固定化反胶团漆酶其在修复土壤DDT污染中的应用.doc

固定化反胶团漆酶及其在修复土壤DDT污染中的应用 赵月春1，付蓉1，莫测辉2*，易筱筠3 1. 华南农业大学应用化学系，广州510640；2. 暨南大学环境工程系，广州510632；3. 华南理工大学环境科学与技术系，广州510640 采用吸附法将反胶团漆酶吸附在表面改性后的硅藻土上，制备固定化反胶团漆酶。探讨了反胶团漆酶固定化的影响因素及其部分酶学特性，并对其在修复土壤DDT污染中的应用进行了研究。反胶团漆酶固定化的最佳温度是35 ℃，载体硅藻土的改性剂Tween-80的加入量为硅藻土质量的15。固定化反胶团漆酶的最适作用温度为35 ℃，最适作用pH为3.55.0；与游离漆酶相比，固定化反胶团漆酶的热稳定性和酸碱稳定性都显著提高。采用游离漆酶和固定化反胶团漆酶修复DDT污染土壤，游离漆酶处理中DDT总量（DDTs）的降解率为50.53%，而固定化反胶团漆酶处理中DDTs的降解率高达69.17%。固定化反胶团漆酶处理较游离漆酶处理的DDTs降解率提高了近20%。 反胶团漆酶固定化稳定性DDT 中图分类号：Q93 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（200）0-0606-05漆酶EC ）是一种含铜的氧化酶，由于漆酶能催化氧化多种环境污染物，因此，在环境保护方面得到广泛的应用。有机氯农药DDT作为一种高效的杀虫剂曾被广泛使用。DDT具有高毒、高残留、持久性和生物蓄积性等特征，对生态环境和人体健康有严重危害[1]。尽管我国早在1983年就停用DDT，但各地土壤中其检出率仍然很高，一些地方甚至超标较严重，导致一些农产品中的DDT检出率高达100%[2]。因此，需要对DDT污染土壤进行修复，以确保农产品安全和人体健康。 本文的前期研究表明，漆酶能有效降解残留在土壤中的DDT[3]。但是由于土壤中土壤胶体的吸附、过酸或过碱以及土著蛋白酶的生物降解等作用，可导致漆酶在使用过程中变性失活，进而引起降解效率下降等问题，限制了它的应用。为了有效保持漆酶的活性和稳定性，很多学者研究了漆酶固定化技术，主要的技术有吸附法[4-6]、交联吸附法[7-9]、共价键结合法[10-12]和包埋法固定化酶[13-15]。在吸附法中通常是将漆酶直接吸附在无机吸附剂上，如Gianfreda等将漆酶直接固定在蒙脱石、高岭土等载体上，保持了酶的活力和稳定性[16]。但该方法仍存在酶与载体结合不牢固，易脱落引起酶失活现象，使得降解效率降低[17]。本实验采用先将漆酶制备成反胶团漆酶，然后将反胶团漆酶吸附在改性硅藻土上的方法制备固定化反胶团漆酶，并对固定化反胶团漆酶的部分酶学性质以及其在修复土壤DDT污染中的应用进行了研究。 供产漆酶的多孔菌购自中国科学院广州化学有限公司。邻联甲苯胺（上海化学试剂总厂）。AOT气溶胶（浙江嘉善巨枫化工厂）。Tween-80（上海申宇医药化工有限公司）。Sephadex G-75葡聚糖凝胶（瑞典Pharmacia Biotech 公司）。供试土壤赤红壤取自华南农业大学树木园，其质地为粉沙质壤土，pH水/土=2.5/1为5.35，有机质为7.89 g.kg-1，氮、磷、钾分别为0.71、0.72、2.61 g.kg-1，DDT未检出（检出限见下文）。DDT的4种组分P,P’-DDE、O,P’-DDT、P,P’-DDD和P,P’-DDT的标准物质购于美国Supelco公司。将多孔菌接种到以甘薯粉作碳源的好气纤维分解菌固体培养基上活化，等菌种布满培养皿表面时用10 mm的打孔器接种到马铃薯液体培养基中，每50 mL培养液接入一片，放入28 ℃转速为130 r·min-1的恒温摇床培养9 d后离心，取上清液即得漆酶液。经盐析和Sephadex G-75柱层析纯化进一步提高其活力，制得游离漆酶[18]。 在100 mL容量瓶中依次加入pH为4.6浓度为0.02 mol·L-1的醋酸-醋酸钠缓冲液0.64 mL、酶活为37 U游离漆酶液2 mL和含0.1 mol·L-1 AOT气溶胶和0.0125 mol·L-1 Tween-80的异辛烷溶液97.36 mL，然后在磁力搅拌器上搅拌12 h得到含水量为15的反胶团漆酶液。 取3 g的硅藻土作载体，加入一定量的Tween-80对硅藻土进行表面改性，充分搅拌均匀后加入含水量为15的反胶团漆酶液25 mL，混匀后在30 ℃下搅拌干燥，直至其成固体粉末状，制得固定化反胶团漆酶。 以邻联甲苯胺为底物。取0.1 mL 游离漆酶液和0.6 g固定化反胶团漆酶，分别加入0.1 mol·L-1，pH 4.6的醋酸盐缓冲液3.4 mL，再加入3.36 mmol·L-1的邻联甲苯胺0.5 mL，放入25 ℃恒温箱中培养25 min后，放入25 ℃下4000 r·min-1的离心机上离心5