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进境辣椒中低龄辣椒实蝇幼虫鉴定 　　摘要：自菲律宾进境旅客携带的小红辣椒中截获1头低龄实蝇幼虫。分别用辣椒实蝇（Bactrocera lati-frons）、橘小实蝇（B. dorsalis）和地中海实蝇（Ceratitis capitata）的特异性引物lati1/lati2、PF-1/PF-2和CCCA-COL-L/CCCA-COL-R对样品总DNA进行PCR扩增和测序后，与Genbank中已知序列比对，结果表明该实蝇与Genbank中辣椒实蝇（FJ903498.1）的同源性达99%。结合形态学特征，确认截获的样本为辣椒实蝇（Bactrocera latifrons）。 　　关键词：辣椒实蝇（Bactrocera latifrons）；低龄幼虫；形态学鉴定；分子生物学鉴定 　　中图分类号：S41-30 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）18-4385-03 　　辣椒实蝇（Bactrocera latifrons）、橘小实蝇（B. dorsalis）和地中海实蝇（Ceratitis capitata）属双翅目（Diptera）实蝇科（Tephritidae），其中辣椒实蝇和橘小实蝇属果实蝇属（Bactrocera），主要分布在东南亚地区；地中海实蝇属小条实蝇属（Ceratitis），原产西非，现已随果蔬传播到90多个国家和地区[1]。这3种害虫的形态和寄主都十分相似，可为害多种水果和蔬菜，主要以幼虫寄生在果实内造成危害。此3种昆虫均为国际上关注的具有重要经济意义的害虫，中国已将其列为进境植物检疫性有害生物[2]。近年来，中国口岸经常从泰国、菲律宾、越南等东南亚地区进境的水果和蔬菜中截获这3种害虫[3-8]，因此，这类害虫随进境果蔬传入中国的风险极大，严重威胁中国农业生产安全，应加强入境果蔬的检疫查验，防止此类有害生物的传入。2011年7月18日，重庆出入境检验检疫局在对从菲律宾入境旅客携带的红辣椒实施检疫的过程中，截获了一头实蝇幼虫，由于该虫仍处于低龄阶段，难以通过形态学准确鉴定，所以应用分子生物学方法对其进行鉴定。 　　1 材料与方法 　　1.1 供试样品 　　2011年7月18日在从菲律宾进境旅客携带的红辣椒中截获1头实蝇幼虫，样品储存于75%乙醇中。对照样品为实验室保存的东南亚进境果蔬中常见的辣椒实蝇、橘小实蝇和地中海实蝇样本。 　　1.2 形态观察 　　将幼虫样本放在Nikon SMZ800体视显微镜下进行形态特征观察并拍照。 　　1.3 基因组DNA提取 　　使用DNeasy Tissue Kit（Qiagen，Germany）试剂盒???取DNA。保存于-20 ℃冰箱中。 　　1.4 PCR扩增 　　参照文献[9，10]，采用辣椒实蝇、橘小实蝇和地中海实蝇的特异性引物lati1/lati2、PF-1/PF-2和CCCA-COL-L/CCCA-COL-R[生工生物工程（上海）股份有限公司]；PCR反应体系： 10×PCR buffer 2.5 μL、MgCl2（2 mmol/L）2.5 μL、dNTPs（0.2 mmol/L）2 μL、引物各1 μL（0.2 mmol/L）、Taq DNA polymerase 0.2 U、模板DNA 3 μL、ddH2O 13.8 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。取3 μL PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像系统进行拍照观察。 　　1.5 PCR产物测序及比对 　　将扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序，测序结果经软件比对后进行校对和拼接。拼接完成后与GenBank中已发布的DNA序列进行比对，确定其种类。 　　2 结果与分析 　　2.1 形态描述 　　幼虫蛆式，体长约2.5 mm，体乳白色透明，12节，腹部每节腹面的纺锤区有小刺（图1a）；头咽骨片末端的附属片以纺锤形裂口与咽骨角相分离，口针有1端前齿，舌悬骨甚长；前气门突起呈黄褐色，形状类似扇形，指突15～17个（图1b）；后气门具3个气门裂，被骨化板所围绕，周围具4丛毛群（图1c）。 　　2.2 分子生物学鉴定结果 　　分别用引物lati1/lati2、PF-1/PF-2、CCCA-COL-L/CCCA-COL-R扩增截获样品的总DNA，并与相应阳性对照作比较。结果显示，仅辣椒实蝇特异性引物lati1/lati2产生扩增反应，得到约330 bp的PCR产物，且与阳性对照序列长度一致（图2a），橘小实蝇、地中海实蝇特异性引物均未产生扩增反应（图2b，图2c）。PCR测序后经校对和拼接，得到一条321 bp的序列（图3），