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山葡萄转录因子CBF1基因克隆及其遗传转化体系 　　摘 要：根据山葡萄的CBF1基因序列设计一对特异引物，克隆出山葡萄（Vitis amurensis）栽培品种 ‘双优’的抗寒转录因子CBF1基因，并将其构建到pBI121表达载体中，获得山葡萄转录因子CBF1基因的植物表达载体，命名为pBI121-ViCBF1，利用农杆菌介导叶盘转化‘巨峰’葡萄以研究高效的‘巨峰’葡萄转化体系。结果表明，以农杆菌LBA4404为介导菌株，以‘巨峰’葡萄叶片为外植体、3 d为预培养时间和4～5 d共培养时间、400 mg·L-1羧苄青霉素，50 mg·L-1卡那霉素筛选浓度转化效果较好，并已筛选到6株转基因植株，PCR检测均为阳性，为提高‘巨峰’葡萄的抗寒性建立了初步的技术基础。 　　关键词：山葡萄；表达载体；转录因子；遗传转化 　　中图分类号：S663.1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.02.002 　　Cloning of Transcription Factor CBF1 of Vitis amurensis and Its System of Genetic Transformation 　　LIU Yang 　　（Changchun Vocational University， Changchun， Jilin 130033，China） 　　Abstract： Designing a pair of single primer by CBF1 gene of Vitis amurensis，cloning transcription factor CBF1 gene of Vitis amurensis， the vector of pBI121-ViCBF1 was constructed and transformed to Vitis labruscana Kyoho by agrobacterium-mediated method. The regenerated resistant plants could be obtained by pre-culturing for 3 d， coculturing with Agrobacterium tumefaciens LBA4404 for 4～5 d， and then transferred to the callus inducement media containing 400 mg·L-1 Carb and 50 mg·L-1 Kan for 28 d. Under this construction， the rate of plant transformation was relatively higher and six putative transgenic plants had gotten， product of PCR was positive， the system was an elementary technology for increasing cold resistance of Vitis labruscana Kyoho. 　　Key words： Vitis amurensis； expression vector； transcription factor； genetic transformation 　　当前，随着农业生态环境的不断恶化，低温、干旱及高盐严重威胁着现代化农业的发展。我国东北和西北两地农作物冻害发生普遍，因冻害所造成的损失也十分严重。我国东北山葡萄抗寒性最强（耐-40 ℃低温），在山葡萄中发现的CBF 低温反应途径是，通过CBF 转录因子调控大量下游有CRT/DRE（C-repeat/dehydration responsive element）调控元件的COR（cold-regulated）基因的表达，来提高植物的抗冻力[1-2]。据报道，大量表达拟南芥CBF1基因的转基因植物，其抗寒性平均提高了10.8 ℃[3]。因此，大量表达抗寒功能更强的山葡萄CBF1基因的‘巨峰’葡萄，其抗寒能力很可能强于转拟南芥CBF1基因的植株，这种转基因‘巨峰’葡萄将能在东北乃至更寒冷的地区露地安全越冬，从而改变传统的“埋土防寒”措施，减少作物因低温天气造成的减产，具有广阔的应用前景。 　　1 材料和方法 　　1.1 材 料 　　山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）栽培品种‘双优’、‘巨峰’葡萄（Vitis labruscana Kyoho）、大肠杆菌E.coli DH5α、农杆菌LBA4404感受态细胞、表达质粒pBI121均由吉