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TMV溶液诱导蚕豆根尖微核研究 　　摘要： 应用蚕豆根尖微核试验初步研究了一定浓度的烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV） 溶液对环境污染的效应。结果表明，TMV溶液浓度与各处理蚕豆根尖微核率的相关性较强（r=0.982），且差异极显著 （P=0.0030.01），且蚕豆根尖微核率与处理时间相关性不强（r=0.312）。研究表明蚕豆根尖细胞微核技术可应用于烟草花叶病毒遗传毒性监测。 　　关键词：烟草花叶病毒（TMV）；蚕豆根尖；微核率 　　中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）03-0561-03 　　存在于水体中的植物病毒可能导致植物病毒病流行，给农业生产带来不良影响。目前很难估计水体中植物病毒对农业生产的潜在威胁程度，但烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV） 通过植物根侵染植物已得到证实。曾嵘等[1]研究发现在烤烟漂浮育苗中，TMV可以通过营养液侵染烟苗发病；刘勇等[2]研究表明水窖水体中的TMV具有侵染力。已有从水体中分离到烟草花叶病毒的报道[3-9]，水体中存在的TMV有可能对环境造成一定的污染。 　　环境污染物（如物理、化学、生物污染源）能诱发植物细胞的染色体畸变，染色体断片游离在细胞质中于分裂末期形成微核。蚕豆根尖细胞微核试验（Micronucleus test，MCNT） 是以蚕豆根尖细胞微核出现的频率为测试终点的监测方法[10]。目前对水体植物病毒污染及其环境效应的研究极少，本研究以不同浓度的TMV溶液处理蚕豆根尖，分别统计各处理的蚕豆根尖微核率以及相应的污染指数，旨在初步探讨一定浓度的TMV溶液对环境污染的潜在威胁。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　供试蚕豆为青皮蚕豆（本地种），供试病毒为烟草花叶病毒的普通株系。 　　1.2 方法 　　1.2.1 供试病毒液的制备 将纯化的TMV接种于普通烟株K326（Nicotiana tabacum cv. K326），3周后采病叶提纯TMV病毒[11]，经紫外扫描测得其浓度为109.9 μg/mL[12]，并将其稀释，配成浓度分别为2.7、5.4、8.1、10.8和13.5 μg/mL的病毒液各10 mL，4 ℃保存备用。 　　1.2.2 蚕豆根尖的制备 选取颗粒饱满、大小均匀的青皮蚕豆，用10%的过氧化氢溶液浸泡15～20 min，清洗2～3次，去离子水浸泡26～30 h，吸胀后25 ℃恒温培养。待根长至1???2 cm时，选取初生根尖生长良好、根长一致的蚕豆，随机分成14组，每组30个备用[13]。 　　1.2.3 蚕豆根尖的处理及恢复培养 将上述备用蚕豆中5组分别用配制的5个浓度的TMV溶液处理4 h，另5组用浓度为10.8 μg/mL的TMV溶液分别处理4、8、12、16和20 h，并以去离子水处理为阴性对照（CK1），以PBS液处理为阳性对照 （CK2），以上处理过的蚕豆用去离子水浸洗3次后25 ℃恢复培养24 h。 　　1.2.4 蚕豆根尖的固定与解离 恢复培养后的蚕豆分别剪下根尖前端1 cm用卡诺固定液固定24 h后，用体积分数90%和70%的乙醇各浸洗两次，每次0.5 h，体积分数70%的乙醇4 ℃保存[13]。将固定好的蚕豆根尖用去离子水浸洗2次，每次5 min，1 mol/L HCl 60 ℃水浴解离5 min，去离子水浸洗2次，每次5 min。 　　1.2.5 制片和镜检 取2 mm左右根尖分生组织，涂片，染色，压片。每个处理及对照组蚕豆根尖至少镜检20个装片，每个装片在高倍镜下观察和统计约1 000个细胞的微核数。细胞微核率（MCN） =含微核的细胞数/观察细胞总数×1 000‰ 　　2 结果与讨论 　　2.1 TMV溶液浓度对蚕豆根尖微核率的影响 　　试验用5个浓度的TMV溶液和PBS、去离子水各处理蚕豆根尖4 h，蚕豆根尖产生的微核率及污染指数结果见表1，去离子水和PBS处理的蚕豆根尖微核率都低于3‰，5个浓度的TMV溶液处理的蚕豆根尖微核率都高于5‰。不同处理的各组间进行方差分析和多重比较表明，用去离子水和PBS处理的蚕豆根尖微核率与TMV溶液处理的的蚕豆根尖各组间微核率差异均极显著（P0.01），相关性分析结果显示，相关系数r=0.312（P=0.610）。 　　TMV一般不侵染豆科作物，周雪平等[15]从蚕豆上分离鉴定了TMV，该分离物在蚕豆上致病力很强。本研究发现TMV溶液可以诱导蚕豆根尖细胞微核的形成，具有一定的遗传毒性，致使寄主染色体发生一定程度的畸变，长期以来很可能影响寄主在环境中的生存、遗传和进化。郑耀通等[16，17]研究认为TMV可在不同的水体环境中存活相当长时间，且有可能随流动的水体而