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* MLPA技术原理 MLPA 技术原理 王晓琳 2002 年，荷兰科学家发明了一种名为多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification， MLPA) 的高通量的基因检测方法，该技术利用核酸杂交、连接反应和 PCR 扩增反应，可以在同一反应管内对多达 45 种不同的核苷酸序列进行检测和定量分析。 MLPA 技术原理 该技术主要包括：探针与靶序列的杂交、探针的特异化连接、连接探针的扩增和结果的检测分析。针对每一个待测靶基因序列，均有一对 MLPA 探针，其由一个短的寡核苷酸片段（短探针）和一个长的寡核苷酸片段（长探针）组成。该技术的特色之一是仅扩增连接完好的探针，而不是扩增样本靶序列。 MLPA 技术原理 该技术的扩增环节仅需 2 条引物，一是引物 GP1，另一是引物 GP2。在所有短探针的 5’端均有一段共同序列，该序列与引物 GP1 的核酸序列相同；在所有长探针的 3’端均有一段共同序列，该序列与引物 GP2 的核酸序列互补。可见，所有连接探针的 PCR 扩增用的是同一对引物。 MLPA 技术原理 若两探针连接，则扩增可进行；而若两探针未连接，则扩增无法进行。各长探针在共同序列和与靶序列互补的序列间有不同长度的填充片段，该片段长度不同使连接后的MLPA探针长度不同，故其扩增片段长度亦不同。一般相临两产物的长度相差6～8 bp，因此可同时检测基因组的多种不同靶基因。扩增后进行结果检测分析比对，得出结论。 MLPA 技术原理 MLPA 技术原理 MLPA 技术原理 MLPA 技术原理 MLPA 技术原理 MLPA 技术原理 多重连接探针扩增技术融合了 DNA 探针杂交和 PCR 技术的特点，且发扬了其连接依赖的特色，优点如下： MLPA 技术原理 Add Your Text 多种靶基因位点进行检测 所需样本量小，最 少仅需 20 ng DNA 即可完成检测 检测方法灵活 Add Your Text 检测精确度高，能够检 测出单个碱基的突变 或 SNP 及基因拷贝数 一倍量的增加或减少 可实现多重分析，同时对 耗时短，24 h 内即可出结果 自动化程度高 MLPA 6 大优点 MLPA 技术原理 LOPMTM-MLPA实验的 3 个步骤： MLPA LOPMTM 针对目标序列和用于制备长 探针的与待检测靶片段无关的模 板UT（Unrelated Template），如质 粒等设计进行PCR扩增的引物，其 中的一条引物进行生物素标记，以 质粒为模板进行PCR扩增，从而获 得特异长度的生物素标记的核酸 序列，利用亲和素磁珠进行纯化， 最终获得单链寡核苷酸（非生物素 标记），从而制备获得长度特异的 寡核苷酸单链。 针对每一个待测靶基因序 列，均有一对 MLPA 探针，由一 个短的化学合成寡核苷酸片段 和一个长的通过磁珠法制备的 寡核苷酸片段组成。检测时先使 待测双链 DNA 变性解链，加入 连接酶，调节连接温度。若待测 核酸中含有靶序列，则两个探针 与待测核酸互补良好，连接反应 可进行，反之，若其中一条探针 的序列与待测靶基因序列不完 全互补，甚至只有一个碱基不互 补，也会使杂交不完全而使连接 反应无法进行。 结果检测 ★ 琼脂糖凝胶电泳 ★ PAGE ★ 毛细管电泳 ★ 固相芯片法 ★ 液相芯片法 ★ DHPLC MLPA 技术原理 针对目标序列和用于制备长探针的与待检测靶片段无关的模板U（UnrelatedTemplate），如质粒等设计进行PCR扩增的引物，其中的一条引物进行生物素标记，以质粒为模板进行PCR扩增，从而获得特异长度的生物素标记的核酸序列，利用亲和素磁珠进行纯化，最终获得单链寡核苷酸（非生物素标记），从而制备获得长度特异的寡核苷酸单链。 LOPMTM MLPA 技术原理 针对每一个待测靶基因序列，均有一对 MLPA 探针，由一个短的化学合成寡核苷酸片段和一个长的通过磁珠法制备的寡核苷酸片段组成。检测时先使待测双链 DNA 变性解链，加入连接酶，调节连接温度。若待测核酸中含有靶序列，则两个探针与待测核酸互补良好，连接反应可进行，反之，若其中一条探针的序列与待测靶基因序列不完全互补，甚至只有一个碱基不互补，也会使杂交不完全而使连接反应无法进行。 *