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HPLC法测定陆英中绿原酸含量 　　摘 要：本研究以陆英为研究对象，对具有抗肝炎活性的化学成分绿原酸进行了提取工艺、含量测定方法的研究。实验结果表明：绿原酸在0.8～40 μg/ml浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.9998，平均回收率为96.1%，RSD值为4.5%。该方法准确性、重复性好，为评价陆英质量提供了一个定量依据。 　　关键词：陆英 提取工艺 质量评价 高效液相色谱法 　　中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2012）12（b）-0-01 　　该文建立了陆英药材中绿原酸的HPLC含量测定的方法，该方法简便、准确、重复性好，为全面评价陆英药材质量提供了定量依据。 　　1 药品、色谱条件及其优化、对照品溶液和供试品溶液的制备 　　1.1 药品 　　绿原酸对照品，中国药品生物制品检定所提供。 　　1.2 色谱条件 　　色谱柱：phenomenexC18反相色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）。流动相：（A）乙腈-（B??0.8%甲酸水溶液梯度洗脱：0～12 min： 　　A7%升至11%，B 93%降至89%； 　　12～49 min：A11%升至25%B89%降至75%。检测波长：326 nm。流速：1.0 ml/min。柱温：35 ℃。进样量：20 μl。 　　1.3 色谱条件的优化 　　①流动相系统的考察：试验采用乙腈-水系统，由于目标成分为酸性物质，经试验测定，最终确定采用乙腈-0.8%甲酸水溶液系统进行梯度洗脱。②流速的影响：考察了流速为0.8、1.0、1.2 ml/min对分离效果的影响，结果表明流速为1.0 ml/min时分离效果最佳。③柱温的影响：考察了柱温为30、35 ℃对分离效果的影响，结果表明柱温为35 ℃时分离效果最佳。综上所述，最终确定以采用乙腈- 0.8%甲酸水溶液系统进行梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，柱温为35 ℃。 　　1.4 对照品溶液的制备 　　分别取绿原酸的对照品适量，精密称定，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为 　　0.402 mg/ml的标准储备液I，备用。再精密量取储备液I 0.10 ml，置5 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为8.04 μg/ml的标准储备液Ⅱ。 　　1.5 供试品溶液的制备 　　取陆英药材粉末约1.0 lg，精密称定，至100 ml锥行瓶中，加100 ml85%甲醇溶液，超声提取1.0 h。抽滤，旋转蒸发至近干，用甲醇转移至10 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）过滤后取续滤液作为供试品溶液。 　　2 结果 　　2.1 标准曲线的绘制 　　依次分别精密称取绿原酸的储备液I 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml置于10 ml量瓶中；再分别精密称取储备液Ⅱ1.0 ml，至10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成7个不同浓度的标准溶液。分别取上述溶液20 μL进样，在上述色谱条件下进行HPLC分析，以对照品峰面积A对浓度C（μg/ml）回归分析，得绿原酸的标准曲线，绿原酸的回归方程为：A=5.8×104C-28121（r=0.9998，n=7）。结果表明，绿原酸在0.8～40 μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。 　　2.2 检测限（LOD）和定量限（LOQ） 　　检测限是信噪比为3时的被测物浓度，为能从背景信号中区分出被检测物的最低浓度。定量限是信噪比为10时的被测物浓度，是指在保证具有一定可靠性的前提下，能够测定出的样品中被测物的最低浓度。通过重复测量3次求的平均值，RSD平均值小于5%，绿原酸的检测限和定量限分别为1.28 ng/ml和3.84 ng/ml。 　　2.3 重复性试验 　　取陆英药材粉末5份，约1.0 g，精密称定1.005 g。进行HPLC分析，记录色谱图峰面积：412028、389181、390383、412370和419431，RSD=3.4%。 　　2.4 稳定性试验 　　取陆英药材粉末约1g，精密称定，按“供试品溶液的制备”的方法制备供试品溶液，避光保存，备用。分别在0，4，8，12，24，48 h测试一次，记录色谱峰面积分别为：381583、380548、377956、376437和374985，RSD为0.7%。结果表明所有分析物在常温下，48 h内保持稳定。 　　2.5 回收率试验 　　向含量已知的陆英样品中加入已知量（72.6 μg）的混合标准储备液，然后进行提取和HPLC测试，通过测得量和加入量的比值计算回收率 。提取回收率考察了3个不同浓度，即分别在标准曲线的高、中、低三个水平，每个试验重复三次，计算平均回