基因诊断3分析.ppt

福建医科大学附属福州市第一医院 实验诊断教研室 费政芳 基因诊断的含义 在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断。它是以遗传物质（如DNA或RNA）为检查对象，利用分子生物学技术，通过检查基因的结构或表达量的多少来诊断疾病的方法。 遗传物质的分类 外源性基因：侵入机体的病毒、细菌、支原体、等病原微生物的基因 内源性基因：如癌基因、抑癌基因或突变的基因 基因诊断的主要用途 感染性疾病病原体诊断 肝炎病毒（甲肝DNA、乙肝DNA、丙肝RAN等） 结核杆菌（肺结核、肾结核） 肺炎（支原体、衣原体） 从理论上来讲某种微生物的基因序列已知，都可以用基因诊断方法来检测。 应用难点: (1)特异基因的选择 (2)目标基因的突变与已知基因不符； (3)目标基因的获得即：标本的采集 基因诊断的主要用途 先天遗传性疾病诊断 基因缺失、突变性疾病诊断 例如：a地中海贫血，其发病机制是合成血红蛋白的珠蛋白a链基因减少或缺失导致血红蛋白结构异常，导致贫血。 应用难点：致病基因的确定 肿瘤的基因诊断 直接检测肿瘤相关基因 癌基因：H-ras k-ras c-myc 原癌基因：CEA 、AFP 抑癌基因：P53，突变会失去抑癌功能 应用难点：特异性不强、个体差异大、方法学要求高（正常人也有携带） 基因诊断的主要用途 产前诊断（TORCH、唐氏综合） 亲子鉴定（HLA） 药物代谢基因诊断 法医物证 应用难点：目标基因的富集（实验条件、技术要求较高） 基因诊断先进性 具有明确诊断性：直接发现病因 具有早期性、预防性 在临床表现出现前做出诊断提前干预 如：肿瘤 灵敏度高：少创产前诊断 快速诊断：SARS的实验室诊断 常用技术 （一）核酸分子杂交 （二）DNA测序 （三）聚合酶链反应（PCR） （四）连接酶链反应（LCR) （五）单链构象多态性分析(SSCP) (PCR-SSCP) （六）限制性片段多态性（RFLP） （七）单核苷酸多态性分析 （八）基因芯片技术 （一）核酸分子杂交 定义：核酸分子杂交是指两条互补单链核酸（DNA或RNA）在一定条件下按碱基互补原则退火形成双链的过程。 (A-T)(C-G)(A-U) 杂交的双方是探针与待检核酸，杂交后形成的双链分子称为杂交分子（DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA） 核酸分子杂交种类 Southern 印迹杂交又称DNA印迹，是英国科学家Southern1975年发明的一种特定检测DNA片段的方法。 基本原理 将基因组DNA用一种或几种限制性内切酶消化成大小不同的片段，消化后用电泳的方法将这些DNA按大小不同进行分离，分离后通过原位变性，将其转印到固相支持物上如：硝酸纤维素薄膜，再应用特异的同位素标记的DNA或RNA探针进行杂交，然后通过对杂交信号的检测来确定探针互补条带的位置。基因的缺失或突变可能导致带的缺失或位置改变。 Northern印迹杂交是一种研究RNA的方法，可用于测定细胞的总RNA或mRNA分子量的大小。 斑点杂交亦称狭缝杂交。 例如:人乳头瘤病毒高危亚型的鉴定 PCR 产物用于定性或半定量检测 一次可测30种左右的分型 原位杂交（ISH) 基本原理：在保持细胞基本形态的情况下，用放射性核素或非放射性核素标记的探针与细胞内的DNA或RNA进行杂交。 若探针是同位素标记，杂交后需用X光片进行放射自显影，然后观察暴光点在组织或染色体分裂象上的相对位置。 若探针用荧光标记 即 荧光原位杂交(FISH)，杂交后用荧光显微镜直接观察, FISH技术已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。 分子杂交共同点 应用了核酸序列的复性原理 都采用了标记探针 （二）DNA测序 临床意义：由于临床上进行各种突变分析的最终目的是获得突变信息，即确定具体的突变类型，因而不管先通过何种方法进行突变筛查，最终都会落实到DNA测序上。 双脱氧链终止法 目前应用最多 Sanger等1977年提出的。 基本原理：DNA聚合酶利用单链DNA作为模板，准确合成互补DNA链，它不仅可以已单脱氧核苷酸dNTP)为底物，而且可以以双脱氧核苷酸（ddNTP)为底物，ddNTP，若在合成过程中3，-末端掺入了ddNTP，DNA链的生长将会被终止，因此生成一系列不同长度的DNA片段。 临床应用:亲子鉴定 DNA是人体遗传的基本载体，人体细胞有23对的染色体，其分别来自父亲和母亲。尽管遗传多态性的存在，但每一个人的染色体必然也只能来自其父母，这就是DNA亲子鉴定的理论基础。 其他测序方