六SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量.PPT

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量生物化学与分子生物学教研室徐宏伟 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylanfide gel electro-phoresis) 即SDS法 蛋白质纯度检测 测定分子量 相对分子质量是蛋白质的一个重要参数 依据蛋白质的某些理化性质测定其相对分子质最，诸如渗透压、离心沉降、排阻层析、粘度等。 本实验利用SDS法，测定蛋白质的相对分子质量。 是目前分子生物学中常用的方法之一。 采用SDS—PAGE法测定蛋白质的分子量简便、快速、重复性好， SDS-连续系统电泳 SDS-不连续系统电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直柱型电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 丙烯酰胺 Aｃｒ 单体 甲叉双丙烯酰胺 Bｉｓ 交联剂 TEMED(四甲基乙二胺) 加速剂 过硫酸铵 催化剂 网孔的大小取决于丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度及两者的比例。一般使用的凝胶浓度为7.5%（该实验根据低相对分子质量标准蛋白质定为12%） 1964年Daris等首先使用不连续电泳体系分离血清蛋白质。 电泳槽中的缓冲体系，pH值与凝胶中不同，凝胶本身也由缓冲体系，pH值，凝胶孔径不同的两种凝胶组成，虽然不连续电泳体系制胶麻烦些，但它对样品有高度浓缩效应，因而可大大提高分辨能力。 三个不连续： 缓冲液组成，缓冲液pH值，凝胶孔径 如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入一定量的SDS，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其他因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。 加入一定量的SDS,使蛋白质样品与SDS结合形成带负电荷的复合物 SDS是一种阴离子去污剂，能破坏蛋白质分子之间以及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的空间构象。 特别是在强还原剂，如巯基乙醇存在下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开，不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电荷的蛋白质—SDS复合物。 这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。 SDS与蛋白质结合后，近似于雪茄烟形的长椭圆棒 由于复合物分子量的不同，在电泳中反应出不同的迁移率。 当蛋白质的分子量在15 000--200 000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系，符合下列方程式： IgMW = -b·mR + K 式中：MW为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。在条件一定时，b和K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图， 可获得一条标准曲线。 未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS—不连续系统垂直板型凝胶电泳。 仪器及材料 DY—1型电泳仪 垂直板状电泳仪(Bio-RADMini-PROTEANⅡCELL) 微量进样器、带针头注射器、染色缸、脱色缸、刮勺 刻度尺、小锥形瓶、吸量管、滴管、刀片、回形针 操作步骤 (一)低相对分子质量标准蛋白质样品的制备 (二)待测蛋白质样品的制备 加入等体积的样品缓冲液，混匀，在沸水浴中加热3 min (三)垂直板状SDS的灌制 1、安装 2、配制分离胶 3、配制浓缩胶 (四)加样 加入电泳缓冲液 至高出内侧玻板上边约0.4cm 小心移出梳子 用微量进样器吸取已处理好的标准蛋白和待测蛋白样品液5-10μl (五)电泳 浓缩胶的制备：(2ml) 终浓度：5% 水：1.39ml 30%丙烯酰胺：0.32ml Tris-HCl缓冲液（PH6.8）0.25ml 10%SDS：0.02ml TEMED：0.002ml 10%AP：0.02ml 分离胶的制备：(5ml) 终浓度：12% 水：1.65ml 30%丙烯酰胺：2.0ml Tris-HCl缓冲液（PH8.8）1.25ml 10%SDS：0.05ml TEMED：0.002ml 10%AP：0.05ml (六)剥胶 (七)染色和褪色 (八)电泳迁移率的计算 测量染料和蛋白质区带移动的距离（cm），即从分离胶电泳起始至染料区带孔洞及蛋白质区带中心位置的距离。 通常以相对迁移率（relative mobility, Rm）表示蛋白质的泳动行为，其含义和计算方法为： Rm=样品移动的距离（c