猪链球菌噬菌体SMP的抑菌作用及其增殖动力学研究第四版.ppt

猪链球菌噬菌体SMP的抑菌作用及其增殖动力学研究 答辩人：庞亮亮 近几十年来，细菌耐药性的加剧使人类面临着严峻的考验，有人称之为“后抗生素时代”。抗生素已经无法达到理想的治疗效果，噬菌体作为一种新的治疗手段开始受到人们的关注…… 汇报内容 猪链球菌 1998年江苏出现人类感染猪链球菌Ⅱ型 2005年四川再次发生猪链球菌感染人 猪链球菌耐药性 猪链球菌病一直是困扰养猪业的重要疾病，对抗生素呈现严重耐药和多重耐药，迫使人们寻找治疗猪链球菌的其他手段 噬菌体治疗 噬菌体治疗 研究目的之一 研究目的之二 研究内容和技术路线 猪链球菌和噬菌体通用检测方法的建立 实验发现对猪链球菌噬菌体的分离存在很大难度，应用双层琼脂培养法挑取噬菌斑的传统分离方法具有诸多局限性 针对ssb基因建立猪链球菌2型及其噬菌体的通用PCR检测技术，该方法可以同时检测细菌和噬菌体的存在与否 。 染料法荧光定量PCR检测 在一个体系内，SYBR信号强度代表了双链DNA分子的数量 猪链球菌荧光定量PCR检测方法的建立 猪链球菌根据菌体荚膜多糖抗原性的不同，分为35个血清型。猪链球菌的分型基因层次的比血清型更可靠。从实用度角度分析，毒力基因的检测直接关系到它的毒力问题。 使用猪链球菌溶菌酶释放蛋白毒力基因mrp作为猪链球菌检测的目标基因，建立荧光定量PCR检测方法。 噬菌体荧光定量PCR检测方法的建立 针对lysin基因建立噬菌体SMP快速荧光定量PCR检测方法 结合噬菌体SMP快速荧光定量PCR检测和猪链球菌与噬菌体通用检测，把猪链球菌与噬菌体通用检测作为一级检测、噬菌体SMP快速荧光定量PCR检测作为二级检测，可以很方便地检测到猪链球菌噬菌体，为噬菌体分离提供便利。 噬菌体体外增殖动力学 为了进一步定量分析细菌与噬菌体的互作动力学特征，本文进行了细菌与噬菌体共培养的定量实验。将猪链球菌2型与噬菌体SMP共同培养，每隔一定时间取样，使用荧光定量PCR测算细菌与噬菌体的数量。 为了更好地研究噬菌体与其宿主菌的动态关系，定量实验中建立了捕食者数学模型，并根据定量实验的数据，拟合出结果。 噬菌体SMP小鼠抗猪链球菌感染研究 为了研究噬菌体SMP对猪链球菌感染的治疗作用，确认SMP对感染猪链球菌2型的动物具有保护力，进行了小鼠攻击保护试验。 以CD1小鼠作为模式动物，在用猪链球菌攻击后，采用静脉注射SMP进行噬菌体体内抗菌活性研究。 一、通用检测方法的建立 比较了99株细菌或噬菌体，Streptococcus agalactiae、Streptococcus pyogenes 、Streptococcus suis、 Streptococcus sanguinis 、Streptococcus mutans、Streptococcus uberis、Streptococcus thermophilus、Streptococcus pneumoniae 等，它们在很多区段存在很高的保守性，平均超过75% 一、通用检测方法的建立 通用检测方法的建立 在猪链球菌和噬菌体SMP的目标区段检测到条带，回收测序证明是目标条带，而在对照组大肠杆菌及其噬菌体中未发现条带 通用检测方法的建立 通过优化PCR反应条件，检测下限可达104cfu/mL 通用检测方法的意义 实现对猪链球菌2型烈性噬菌体有无的快速初步鉴定 配合200nm滤膜过滤，可实现噬菌体和细菌的分离，加快噬菌体的分离工作，比传统的“盲传”分离更加高效 通用检测方法可以应用到前噬菌体分析 猪链球菌荧光定量PCR检测方法的建立 猪链球菌荧光定量PCR检测方法的建立 用猪链球菌SS2-4、SS2-H、JDZ05802-2、HA9801、9803和19-2（小）荧光检测的结果，都出现阳性结果；而用大肠杆菌和SMP作阴性对照，它的荧光信号并没有增长，说明引物对它们没有特异性 猪链球菌荧光定量PCR检测方法的建立 对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降 猪链球菌荧光定量PCR检测方法的建立 检测下限为个位数模板量，约10-102cfu/mL,比PCR提高了约2个数量级 猪链球菌荧光定量PCR检测方法的意义 建立猪链球菌快速检测机制，该方法特异性明显优于普通PCR、elisa、传感器检测，检测周期明显短于普通PCR、elisa，对猪链球菌的监测防控提供一种可选方法 为后续实验做准备 噬菌体荧光定量PCR检测方法的建立 噬菌体荧光定量PCR检测方法的建立 用5个重复SMP荧光检测的结果，都出现阳性结果；而在2-12中用猪链球菌SS2-4、