蛋白纯化相关知识介绍.pptVIP

Per Pura Ad Astrathrough suffering to renown从纯化到星辰 经典的基本的蛋白质纯化技术分为两类： 粗分级分离：硫酸铵沉淀法和等电点沉淀法，PEI沉淀等。 层析技术：离子交换层析和疏水作用层析,亲和层析等等。 1.一个经典的大肠杆菌表达蛋白实验： 包涵体纯化:包涵体纯化基本原理步骤，缓冲液选择的一些原则，离子交换的使用，规模化上样方法，蛋白的储存 可溶性蛋白纯化等：各种沉淀方法包括硫酸铵沉淀和PEI沉淀等 蛋白质的储存： 《蛋白纯化与鉴定实验指南》 4.常见的柱层析在位清洗和金属螯合柱再生方法: 3.汇报蛋白纯化实验的基本格式： 2.兴风作浪的乳糖操纵子: 分享的主要内容: Richard R. Burgess RNA polymerase and the regulation of transcription Bill Studier T7 RNA polymerase induction system  Since 1989，Cold Spring Harbor Laboratory 蛋白质纯化与鉴定研习班 通过四组具有代表性的、四种不同原材料出发的蛋白质：钙调蛋白、转录因子AP-1、重组Sigma32和胰岛素受体。具体介绍现代生物学和医学实验室中一系列常用的蛋白质纯化与鉴定技术。 浓缩 保存状态 保存条件 保存期限 …… 动物 植物 微生物 常用的破碎方法： 超声处理法： Tris/EDTA/Doc/溶菌酶法： 匀浆器： 高压均质机： “万金油” buffer（TGE）： 50mM Tris pH 7.9， 0.5mM EDTA， 50mM NaCl， 5% glycerol　　  破菌完成后+DOC使其终浓度为0.2%，以释放出少量不溶性的蛋白质。 去垢剂： 两性分子 能取代与膜蛋白的跨膜区相接触的磷脂 保持其活性的前提下增加其溶解性 Cell Disruption Refolding 离子交换： POROS 50S阳离子交换 IB Isolation IB Washing Solubilization Centrifugation Remove Cell Debris Denaturant Partial Removal of Denaturant Complete Removal of Denaturant 13000 r/min 10min 2% DOC wash 2 times:洗涤就是在纯化，纯度越高越容易复性 3% SKL N-十二烷基肌氨酸钠 透析操作/梯度稀释复性： 最简单的方法最有效。 并不需要完全去除去垢剂，留待下步去除。 为什么选择阳离子交换？表面既有负又有正电荷 是否可以用其他层析柱代替？疏水？ 缓冲液的选择要注意什么？ 储存 上样 包涵体部分的纯化： 阴离子交换：避免磷酸缓冲液 阳离子交换：避免Tris 稀释后再调节pH：Tris-HCL，每稀释十倍降低0.1 1M Tris10mM1 每一个蛋白都需要被个性化的对待！ 透析 稀释复性 折叠中间产物容易相互接触形成不溶的聚合物。 仍然是非常常用的一种方法。  搅拌式 工业级纯化设备 并不是所有的纯化都要依赖于AKTA自动化设备！ 并不是多有的纯化都要依赖于His组氨酸标签纯化！ 虹吸原理也可以 不会干的诀窍？ 离子交换层析进一步精纯 在蛋白制备过程中用1：1000 稀释的二巯基乙醇（12mmol/L），而长期储存的时候加入1～5mmol/L DTT 为了避免蛋白变性，可使用浓度0.1%的非离子型去垢剂。 Storage Condition Characteristic Solution at 4°C Solution at 25-50% glycerol or ethylene glycol at -20°C Frozen at -20°C to -80°C or in liquid nitrogen Lyophilized (usually also frozen) Typical shelf life 1 month 1 year Years Years Requires sterile conditions or addition of antibacterial agent Yes Usually No No Number of times a sample may be removed for use Many Many Once;repeated freezethaw cycles generally degrade proteins Once;it is impractical to lyophilize