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Hedgehog信号通路与慢性肝损伤后肝再生调控 　　摘要：目的 初步探讨小肝细胞样祖细胞增殖过程中Hedgehog信号通路的表达及其变化。方法 按Gordon’s方案，Fisher344大鼠腹腔注射倒千里光碱后，择期行部分肝切除术诱导小肝细胞样祖细胞的增殖，反转录聚合酶链反应、实时荧光定量PCR及免疫组化等方法检测原代再生细胞均浆中Hedgehog信号通路相关成分在不同时间点的表达，并以同期正常大鼠原代肝细胞作对照。结果 小肝细胞样祖细胞增殖过程中Hedgehog信号通路多种成分表达，其中IHH、PTCH、Smo、Gli1、Gli2、Gli3 mRNA持续表达并呈动态变化，SHH表达阴性。信号分子IHH，以及反映通路活动状态的3个标志（PTCH，Gli1，Gli3）在同一时间点与对照组之间差异有统计学意义，在实验组内不同时间点之间差异也有统计学意义（均P 　　关键词：Hedgehog信号通路；小肝细胞样祖细胞；肝再生；大鼠 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.05.014 　　中图分类号：R363 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）05-0038-05 　　哺乳动物肝脏存在两类具有干细胞潜能的细胞亚群，卵圆细胞和小肝细胞样祖细胞（small hepatocyte-like progenitor cells，SHPCs），在特殊病理条件下，可以通过分化与增殖，实现肝再生[1-2]。早期的研究证实，SHPCs再生呈一种弥漫分布，持续增殖的过程。但迄今关于这类细胞的起源、特点及调控机制等仍不完全明了[3-4]。有实验分析原代SHPCs基因表达序列，发现 　　通讯作者：蔡毅东，E-mail：doctor_cyd@ 　　有Hedgehog信号通路（hedgehog signaling pathway HH）成分IHH、PTCH的表达[5-6]。HH由于存在天然植物阻断剂，且已有研究证实HH通路阻断可有效抑制多种肿瘤细胞的增殖，促进凋亡，如皮肤基底细胞癌、胰腺癌等[5-7]，因此，研究HH阻断对慢性肝损伤后肝再生的影响，开发具有HH阻断效应的中药同类物或类似物，对未来中医药治疗肝病具有一定的现实意义。因此，本课题持续检测了不同时间点HH多种成分（IHH、SHH、PTCH、Smo、Gli1、Gli2、Gli3）的表达，并从基因及蛋白水平分析信号分子IHH和反映HH活动状态的3个指标（PTCH、Gli1、Gli3）的表达及变化，初步探讨HH在肝损伤及肝再生过程中的作用，以期为进一步开发中药提供实验数据。 　???1 材料与方法 　　1.1 动物与分组 　　雄性SPF级Fisher344大鼠56只，鼠龄5周，体质量（70±10）g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK（粤）2003-0002，在南方医院动物实验中心SPF级饲养室进行喂养与实验。动物饲养条件：温度22～25 ℃，湿度（50±5）%，标准的12 h光照/12 h黑暗节律，标准饲料喂养，自由饮水。所有实验操作遵循南方医科大学实验动物操作条例。 　　适应性喂养1周后，将实验大鼠随机分为实验组，即倒千里光碱联合部分肝切除组35只，正常对照组21只。 　　1.2 药物与试剂 　　倒千里光碱、collagenase Ⅳ购自美国Sigma公司，Williams’E medium购自美国Gibco公司，EDTA溶液购自D-Hanks公司；Trizol购自美国Invirtogen公司，反转录反应体系购自加拿大Fermentas公司，聚合酶链反应（PCR）体系购自美国PABI公司，实时荧光定量PCR预混合反应液购自美国ABI公司；IHH羊多克隆抗体、PTCH兔多克隆抗体、Gli1羊多克隆抗体，以及HRP标记的兔抗羊和羊抗兔多克隆二抗均购自美国Santa Cruz公司。 　　1.3 肝再生实验 　　按照Gordon’s方案[3-4]，实验组大鼠于鼠龄第6周末腹腔注射倒千里光碱（30 mg/kg）1次，第8周重复给药1次，同期正常对照组以等体积生理盐水代替。第2次给药后5周（第13周），实验组行经典的Higgins-Anderson 2/3部分肝切除术，正常对照组予模拟手术，以校正可能由手术刺激、麻醉药物的使用等引起的变化[2]。实验过程中未出现给药和手术引起的大鼠死亡。 　　2组大鼠分别在肝切除术后第2、3、4、7、14、21、30日麻醉后处死，每次分别处死3～5只。结扎切除尾状叶后原位分离肝脏用于原代肝细胞的制备；切取0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm大小的尾状叶组织3～5块放入10%多聚甲醛固定，24 h后石蜡包埋用于免疫组化分析。 　　1.4 原代肝细胞小肝细胞样祖细胞的分离与制