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修饰胶原止血活性研究 　　[摘要] 目的 探讨通过胶原侧链修饰，提高胶原材料的快速止血能力。 方法 通过胶原侧链修饰，制备带不同电荷的胶原，运用血小板聚集及动物创面止血模型评价材料止血活性。 结果 通过zeta电位分析表明，侧链修饰制得带不同电荷的胶原。血小板聚集实验表明甲基化胶原（MC）可以显著增强胶原同血小板之间的作用，其血小板聚集率均显著高于未改性胶原（NC）（P 　　[关键词] 离子化胶原；胶原；血小板粘附；血小板聚集；凝血时间 　　[中图分类号] R [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2013）08（b）-0130-02 　　失血是战创伤导致死亡的重要原因，快速止血是拯救伤员生命的关键措施。对于实质性器官出血、大面积的毛细血管弥散性出血等患者来说，单纯依靠机械性止血的方法是远远不够的。在此情况下，应用药理学方法特别是局部止血材料有效控制伤口出血显得尤为重要。胶原是临床常用的局部止血材料，具有良好的止血性能。胶原蛋白还可与细胞和伤口愈合过程中的生长因子存在很强的亲和力，促进创面修复和组织再生，是一种理想的创面止血材料。但是胶原与一些止血材料（如纤维蛋白胶）相比，止血速度不是最为出色的。止血时间成为止血材料优劣评价的标准，提高胶原材料的止血性能仍是主要的研发要点。胶原的止血机理主要是对血小板的作用，缩短血栓形成时间。由于血小板表面带负电荷，希望通过提高胶原表面正电荷，以加强胶原同血小板之间的相互作用，缩短血栓形成时间，提高止血性能。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　I型胶原（NC，来自新生小牛皮，由本实验室开发、中试、并即将生产）；日本大白兔、SD大鼠，由四川大学华西医学部提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 离子化胶原的制备和结构分析 离子化胶原的制备：参照文献制备甲基化胶原（MC）[1]和琥珀酰化胶原（SC）[2]。将制备的MC、SC冷冻干燥保存待用。 　　Zeta电位测定： 0.2 mg/mL胶原及离子化胶原水溶液于Nano-ZS型纳米粒度及电位仪上测量Zeta电位（英国Marlven公司）。电位测定条件：25 ℃，每次测样采用5次连续测定。 　　1.2.2 离子化胶原的止血活性实验 血小板聚集：血小板悬液???备：将新鲜抗凝血兔全血（兔血：抗凝剂=9∶1）以160 g离心10 min获得富血小板血浆（PRP），以3 000 rpm离心20 min获得贫血小板血浆（PPP）。然后用PPP调整PRP中血小板浓度为150～200×106个/mL，不同胶原溶液用生理盐水配置成200 μg/mL备用，然后按照LBY-NJ4血小板聚集仪的操作步骤进行血小板聚集实验。 　　大鼠断尾止血模型：SD大鼠20只，随机分为4组，明胶海绵组，胶原海绵组，甲基化胶原海绵组和琥珀酰化胶原海绵组。每组5只，1%的戊巴比妥钠67 mg/kg腹腔注射麻醉后，用体积分数为75%的酒精消毒尾巴后，于鼠尾1/2处切断尾，见血液流出后，立即敷以材料，敷压3 min后，每隔30 s揭开材料，观察伤口，直至停止出血。止血后精确称量事先已称量过的材料。计算出血量：出血量（g）=止血后总重量-使用前重量 　　大鼠股动脉创伤出血动物模型：健康成年SD大鼠12只，体重（434±46）g。每只动物左右侧股动脉记为两个样本，随即将24个样本分为4组，明胶海绵组，胶原海绵组，甲基化胶原海绵组和琥珀酰化胶原海绵组，每组6个样本。大鼠麻醉满意后术区常规脱毛、消毒、固定，解剖暴露股动脉。预先精确称量测试材料重量，剪刀剪断股动脉，见血液流出，立即出血部位施以止血材料，并开始计时。轻压1.0 min后揭开材料，观察止血效果，以后每20 s观察1次，直至完全止血，记录止血时间。观察一段时间（30 min）后拿去止血材料，观察是否会继续出血。计算出血量：出血量（g）=止血后总重量-使用前重量。 　　2 结果 　　2.1 Zeta电位 　　由图1可知，MC原中，羧基酯化，氨基游离度增加，Zeta电位由（1.03±0.116）mV变为（18.0±1.87）mV，表面带正电荷；而SC中，氨基酰胺化变为羧基，Zeta电位变为（-27.6±0.859）mV，表面带负电荷，通过侧链修饰改变了胶原侧链基团分布，成功制备了离子化胶原。 　　3 讨论 　　血管受损时，胶原通过局部加强血小板粘附聚集，促使血小板内容物释放，进而激活凝血系统促进血液凝血以填塞受伤血管，达到止血目的。胶原的止血机理主要与血小板的粘附聚集作用以缩短血栓形成时间有关[3-4]。因此，提高胶原同血小板之间的相互作用有助于提高胶原的止血性能。 　　胶原具有复杂的结构以及多样的功能，其引起血小板粘附聚集需要相应的分子量、结构和构象，其活性与胶原具有的1～4级结构