四妙勇安汤合生脉饮对缺氧复氧乳鼠心肌细胞凋亡影响.docVIP

四妙勇安汤合生脉饮对缺氧复氧乳鼠心肌细胞凋亡影响 　　摘要：目的 观察四妙勇安汤合生脉饮对缺氧/复氧乳鼠心肌细胞细胞凋亡的影响，探讨其心肌细胞保护作用。方法 采用胰蛋白和胶原酶联合消化的方法原代培养的SD乳鼠心肌细胞，利用高纯氮气建立心肌细胞缺氧/复氧模型。实验分为正常组、模型组和药物干预组（予四妙勇安汤合生脉饮）。采用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测心肌细胞凋亡率。结果 与正常组比较，模型组及药物干预组心肌细胞凋亡率均升高（P 　　关键词：四妙勇安汤；生脉饮；心肌细胞凋亡；大鼠 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.013 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0035-03 　　近年来实验研究显示四妙勇安汤具有抗动脉粥样硬化、保护血管新生的作用[1]，部分临床试验表明四妙勇安汤加味对冠心病以及急性心肌梗死患者疗效确切[2-3]。生脉饮临床主要用于冠心病、心肌梗死、心力衰竭及各种休克的治疗。四妙勇安汤合生脉饮是否能够起到保护心肌细胞的作用，是否通过参与细胞凋亡影响心肌细胞活性，相关报道很少。因此，本研究观察四妙勇安汤合生脉饮对心肌细胞凋亡的影响。 　　1 实验材料 　　1.1 动物 　　SD乳鼠，出生24 h以内，SPF级，雌雄不限，购于河北医科大学实验动物中心，动物合格证号：1308037。 　　1.2 药物 　　四妙勇安汤合生脉饮药物组成：金银花30 g，玄参30 g，当归15 g，甘草6 g，人参9 g，麦冬9 g，五味子6 g。石家庄 　　市中医院中药房提供。 　　1.3 主要试剂与仪器 　　胰蛋白酶（美国Sigma），DMEM/F12（美国Gibco），Ⅱ型胶原酶（美国Sigma），胎牛血清（奥地利PAA），5-溴脱氧尿嘧啶（Brdu，美国Sigma），α-Actin兔单克隆抗体（美国Epitomics），兔免疫组化试剂盒（北京四正柏），AnnexinⅤ-PI双染试剂盒（MultiSciences）等。311型CO2恒温培养箱（美国Thermo公司），AIRTEC-vs型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），Olympus-IX71倒置相差显微镜（日本OLYMPUS）， Olympus光学显微镜（日本OLYMPUS），流式细胞仪（美国Beckman），低速离心机（北京医用离心机厂）。 　　2 实验方法 　　2.1 四妙勇安汤合生脉饮醇沉药液的制?? 　　按原方准确称取每味中药（金银花30 g，玄参30 g，当归15 g，甘草6 g，人参9 g，麦冬9 g，五味子6 g），加入13倍的去离子水，浸泡30 min后，急火煎煮1.5 h，16层纱布过滤，滤出药渣，隔水浓缩至原药材浓度为2.65 g/mL的药液，此时（60 ℃） 　　药液相对密度为1.21 g/mL。冷却后加无水乙醇，使含醇量达75%，充分搅拌，4 ℃沉淀24 h，虑取上清，水浴浓缩成稠膏。检测pH值7.1～7.2，密封，4 ℃保存备用。使用时加培养液稀释成原药材浓度为133 ?g/mL的使用液，细菌过滤器过滤后使用。 　　2.2 SD乳鼠原代培养心肌细胞的方法及鉴定 　　无菌条件下打开新生SD大鼠胸部，取下心脏，剪成大小约1 mm3小块。用0.08%胰蛋白酶与0.1%Ⅱ型胶原酶（等量混匀）于37 ℃电热恒温水浴锅中进行消化，每次消化约5 min后收集细胞。二次差速贴壁1.5 h后，轻轻吸出上悬液，调整细胞密度约1×106个/mL，每毫升培养液中加入0.1 mmol/L的Brdu。24 h后行第1次换液，以后隔日换液1次。α-Actin免疫组化鉴定为心肌细胞[4]。 　　2.3 SD乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型的建立 　　缺氧实验开始前，给无糖无血清DMEM/F12培养液充高纯氮气以置换培养液中的氧气，高纯氮气自氮气钢罐中释放出时先经过细菌过滤器接无菌输液管，再充入无糖无血清DMEM/F12培养液中。缺氧实验开始时，弃去原培养液，更换无糖无血清培养液，将细胞培养板放置于自制缺氧盒中。自制缺氧盒有进气口和出气口，先用注射器自出气口尽量抽真空，再自进气口向缺氧盒中继续充高纯氮气30～40 min，置换盒中的氧气，关闭缺氧盒的进气口与出气口，在37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养，缺氧4 h。4 h后，各组更换不同目的培养液，继续在37 ℃、5%CO2培养箱中培养2 h，即为复氧。以模拟心肌细胞缺血再灌注损伤[5]。 　　2.4 分组与给药 　　原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为3组。正常组：不进行缺氧/复氧的处理，也不加四妙勇安汤合生脉饮的醇沉药液进行干预；模型组：进行缺氧/复氧的处理，但不加四妙勇安汤合