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人参AGO1基因克隆及序列分析 　　[摘要] 目的：从人参叶片中克隆Argonaute 1（PgAGO1）的全长基因，并利用生物信息学方法进行分析。 　　方法：根据人参EST序列设计特异性引物，采用RACE方法克隆PgAGO1的cDNA全长，并对PgAGO1蛋白的结构进行预测、氨基酸序列多重比对以及构建系统进化树等分析；同时采用实时定量PCR检测PgAGO1基因在人参不同组织根、茎、叶、花和愈伤中表达水平。 　　结果：克隆的PgAGO1全长cDNA为3 776 bp，其中包括5′UTR 204 bp，3′UTR 254 bp，基因内部包含完整的开放阅读框，可编码1 105个氨基酸，预测蛋白质相对分子质量为122.22 kDa，理论等电点pI 9.71；实时定量PCR检测结果表明PgAGO1基因在人参花中的表达量最高，在根中最低。 　　结论：从人参叶片中克隆得到PgAGO1的全长cDNA，为进一步研究该基因在人参组织发育中的调节作用打下基础。 　　[关键词]人参； microRNA； Argonaute 1； RACE； 生物信息分析 　　MicroRNA （miRNA）是真核细胞内一类大小为20～24 nt的内源性非编码单链小RNA，广泛分布于动植物体内，具有高度保守性[1-3]。在植物体内，miRNA通过调节靶基因来控制植物根、茎、叶、花等的形态建成、细胞分化、疏导组织形成以及植物对生物和非生物胁迫的响应，在植物生长、发育和分化等过程中发挥非常重要的调控作用[2-6]。成熟的miRNA通过与RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex， RISC）结合，形成具有切割活性的RNA沉默复合物，再与靶基因互补配对来降解靶基因或抑制靶基因的翻译[4，6-7]。AGO蛋白作为RISC的核心，在小RNA沉默通路中发挥关键作用。拟南芥AtAGO1是目前研究最为透彻的、功能也最为重要的一个AGO蛋白[8-9]，参与miRNA、转录后基因沉默（PTGS）、病毒诱导的基因沉默（VIGS）或抗病毒沉默和ta-siRNA等多个通路。目前，有关AGO蛋白家族的功能和作用机制还未完全清楚，研究主要集中在拟南芥和水稻等几种模式植物中，药用植物人参AGO基因的研究未见报道。 　　本研究以人参叶片为材料，对PgAGO1进行克隆，得到其cDNA全长序列3 776 bp；采用荧光实时定量PCR检测PgAGO1基因在人参不同组织中的表达水平，为进一步研究该基因的作用机制奠定基础。 　　1 材料 　　ETC 811东胜PCR扩增??，CF×96 BIO-RAD荧光定量PCR仪，BIO-RAD凝胶成像系统等；大肠杆菌DH5α，TOP10及DNA快速凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；总RNA提取及RACE试剂盒为Invitrogen产品；Poly（T） Adaptor RT-PCR试剂盒为Ambion产品；DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、pMD18-T Vector，Taq DNA聚合酶、DNA Marker及实时定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程公司；其他试剂为国产分析纯，实验中所用的引物合成以及序列测定由北京三博远志公司完成。 　　2 方法 　　2.1 人参叶片的取材 本实验用于基因克隆的材料为石柱参Panax ginseng C.A. Meyer cv. Shizhu，于2012年4月中旬购自辽宁省丹东市宽甸镇石柱子村参场。经中国医学科学院药用植物研究所人工气候室培育2周后对不同组织RT（root 根），ST（stem茎），LE（leaf叶），FL（flower花） 取材并迅速保存于液氮中。人参愈伤组织EC（embryogenic callus胚性愈伤） 的诱导与取样见[11]。 　　2.2 PgAGO1基因的全长克隆 采用Trizol方法抽提人参叶片总RNA。总RNA的纯化及DNase I消化参照RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）。用Oligotex试剂盒纯化总RNA， 获得mRNA；根据Invitrogen Gene Racer试剂盒对mRNA进行去磷酸化、去帽子结构、连接接头；用SuperScript III （Invitrogen）试剂盒进行反转录， 合成cDNA第一链。根据人参EST 1（Genbank： gb|HS077398.1|）设计引物AGOR1，AGOR2，AGOF1；EST 2（FW1NBNE01A7WLY）设计引物AGOR3，AGOF2；EST 3（gb|DV555249.1|）设计引物AGOR4。AGOR1，AGOR2分别用于5′RACE的第一轮和第二轮；AGOF1，AGOR3用于扩增EST 1和EST2中间未知序列；AGOF2，AGOR4用于