微生物细胞计数酵母观察.ppt

微生物的显微镜直接计数法 大小的测定 马小魁 副教授 研究生：王虎 实验目的 学习使用目镜测微尺和镜台测微尺在显微镜下测定微生物大小的方法。 学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法 实验材料 显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球记数板、酵母菌悬液、美兰染色液、盖玻片、无菌滴管、吸水纸、擦镜纸。 实验原理 测定细胞的大小测定的工具：目镜测微尺 镜台测微尺 目镜测微尺每格实际代表的长度随物镜的放大倍数而改变，也会因使用不同的显微镜而产生误差，因此在使用前必须用镜台测微尺进行校正。 在40×镜下，看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动载物台，使目镜测微尺的0点与镜台测微尺的某一刻度重合，然后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。计算两刻度间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。由于镜台测微尺的刻度每格长10μm，则目尺实际单位刻度： 制作一片酵母菌的盖片，取下镜台测微尺，将盖片置于载物台上，然后在40×镜下用目镜测微尺测量菌体的长和宽。 目镜测微尺的校正 目尺每格长度(μm)=（台尺格数×10）/目尺格数 菌体大小的测定 方法：活菌计数法——平板菌落计数法；总菌计数法——血球计数板或霍瑟（Peroff Hausser）细菌计数板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。 显微直接计数 酵母形态 美兰染色 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型 无色。 用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型． 具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别． ??? 1、?置目测微计→置台测微计→标定目测微计→测菌体大小→记录结果→用毕擦拭干净 ??? 2?、检查计数板→稀释样品→加样→计数→计算→清洗 3、滴加染液→加菌→盖盖玻片→3min放置→镜检 实验总流程 取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖血盖片。 取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。 用10×镜观察并将计数室移至视野中央。 在10×镜下计数：计数4个（或5个）中格的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出计数区总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。 注意事项：计上不计下，计左不计右。出芽计一半 直 接 计 数 微生物菌体大小的测定 目镜测微尺的校正 更换目镜镜头? 更换目镜测微尺镜头（标记为PF）；或者取下目镜上部或 下部的透镜，在光圈的位置上安上目镜测微尺，刻度朝下，再装上透镜，制成一个目镜测微尺的镜头。 ??标定目镜刻度 记录两重叠刻度间的目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。 ?? 计算该倍率下目镜刻度? ?? 标定并计算其他放大倍率下的目镜刻度 ??制备啤酒酵母水浸片。 大小换算 将标本先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺测定每个菌体长度和宽度所占的刻度，即可换算成菌体的长和宽。 ??求平均值 一般测量微生物细胞的大小，用同一放大倍数在同一标本上任意测定l0一20个菌体后，求出其平均值即可代表该菌的大小。 菌体大小测定 微生物菌体大小的测定 1．酵母菌细胞形态的观察取洁净的载玻片一块，用滴管取酵母菌悬滴于载玻片中央，取盖玻片一块，小心地将盖玻片一端与菌液接触，然后缓慢地将盖玻片放下，以避免产生气泡。至此，一片酵母菌水浸标本片就制成了。先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，观察时注意酵母细胞的形状及出芽情况。 2．死活酵母细胞的染色鉴别取0.1％美兰液一滴，滴在一块洁净的载玻片中央，加一滴酵母菌悬液，混合均匀，染色3～5分钟后加盖玻片制成水浸标本片，镜检。 酵母菌细胞形态的观察和死活酵母细胞的染色鉴别 实验结果 目镜测微尺标定结果：40×镜下 倍目镜测微尺每格长度是