基于邻苯二胺—过氧化氢反应体系过氧化物酶反应动力学研究.docVIP

基于邻苯二胺—过氧化氢反应体系过氧化物酶反应动力学研究 　　摘要： 过氧化物酶（peroxidase，POD）是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。主要存在于细胞的过氧化物酶体中，是动植物代谢中应用广泛的一类催化聚合酶。本文基于邻苯二胺（OPDA）-过氧化氢（H2O2）反应体系，对商品辣根过氧化物酶（HRP）和土豆中的过氧化物酶进行了酶反应动力学的研究。 　　关键词： 过氧化物酶；辣根过氧化物酶；酶反应动力学 　　中图分类号：Q554+.6 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2013）17-0310-02 　　0 引言 　　POD广泛存在于自然界中，是动植物代谢中一种重要的生物酶[1]，其中应用最为广泛的为辣根过氧化物酶（HRP）。POD可以应用于工业生产和物质的分析检测等领域，同时POD有很强的氧化特性，在很多领域中可以替代目前的化学氧化剂[2-4]。人们研究了很多植物中的POD，结果发现其对植物的种子萌发及抗氧化有很大的促进作用，而且过氧化物酶与很多植物果实深加工中的褐变反应直接相关[5-7]，因此POD的研究得到了越来越多的关注。 　　酶反应的动力学研究中，主要考虑的是两个参数，即最大反应速率Vmax和米氏常数Km。活性中间络合物学说（intermediate complex hypothesis）认为酶反应都要通过酶（E）与底物（S）结合形成酶-底物络合物（ES），然后酶再催化底物转化为产物（P），同时释放出酶参加下一轮的反应，基于该理论，在稳态系统中，可以推导出米式方程： 　　Km反映了酶与底物之间的结合能力，Km越小，酶与底物的亲和力越大，反之酶与底物亲和力越小。同时Km是衡量反应速度与底物浓度间关系的尺度，因此常可通过Km来确定在酶催化反应中应该使用的底物浓度。因此在酶的研究中，Km是非常重要的一项指标。 　　分光光度法[8-9]因为反应体系简单，反应物易于检测，设备简单易于普及，是目前国内外测定过氧化物酶酶活性应用最普遍的方法。本文基于分光光度法，利用图1所示反应式：测定了商品HRP及土豆中POD的活性，分别计算了两者的酶反应动力学数据。 　　由公式2可知，ΔA/Δt与酶活性浓度成正比，因此可通过测定催化反应体系的ΔA/Δt用于研究和测定HRP 活性。其中，ΔA为酶催化反??线性区域内的吸光度变化；Δt为线性区域的时间间隔，min；ε为测定对象的摩尔吸收系数，μmol-1·cm-1；L为比色池的光程，cm；V为反应体系总体积，mL；v为加入样品的体积，mL。 　　1 仪器与试药 　　实验仪器及实验试剂：分光光度计；电子天平；pH计；HRP（≥250Umg-1，R.Z=3，中科院上海生化所东风生物技术公司）；H2O2（KMnO4法标定其浓度为9.88mol L-1） ；邻苯二胺（OPDA，成都市科龙化工试剂厂）；其他试剂有：柠檬酸钠；柠檬酸；玻璃微珠。试剂均为分析试剂。实验用水均为超纯水。 　　2 分析方法 　　2.1 HRP活性测定 配制pH5.5、浓度为0.1mol L-1的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，使用缓冲液配制一定浓度的OPDA，HRP和H2O2溶液，首先将0.9mL OPDA溶液与0.2mL的HRP溶液加入到比色皿中，充分混匀，以此为标准，调节吸光度A为0值，设计测定波长为423nm。随后加入0.9mL H2O2溶液并混合均匀，总体积为2mL。开始计时，每间隔0.5min记录一次吸光度数值，连续记录至数值不再变化为止。随后以反应时间为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到吸光度随时间变化数值如图2所示，以图中所示ΔA/Δt为基础计算酶活性。 　　2.2 土豆中POD活性测定 一定量的土豆样品首先使用超纯水冲洗干净，放置与研钵中，加入质量为样品质量分数10%的玻璃微珠及柠檬酸盐缓冲液5ml研磨，直至将样品研磨至糊状，转入离心管中，并用柠檬酸盐缓冲液冲洗研钵数次。使用柠檬酸盐缓冲液将总体积定容为20ml，置于离心机中，1500rpm，离心15min。取上清液为样品中POD粗提液用于测定，下层残渣丢弃。 　　使用土豆提取液替代HRP溶液，利用HRP活性测定的方法测定其中POD活性。 　　2.3 实验条件优选 反应过程中，对酶活性测定有影响的因素包括：OPDA浓度；H2O2浓度；缓冲液pH；缓冲液浓度。因此首先对这四个条件进行优选，优选得到最佳的反应条件：OPDA与H2O2浓度分别为1.2mmol L-1和0.35mmol L-1，缓冲液浓度为0.1mol L-1，缓冲液pH为5.5。 　　后续关于酶反应动力学的实验均在最优条件下完成。 　　2.4 商品HRP酶动力学计算 分别对HRP的氧化底物H2O2和还原底物OPDA 作Lineweaver-Bvurk双倒数曲线，