生物工程下游技术第八章谱分离技术.ppt

（3）硅胶的活化 活化硅胶常采用硅烷化试剂，如γ-氨丙基三甲（乙）氧硅烷和环氧丙基三甲基硅烷等，反应为： 引入活性氨基或环氧基后，在酸性溶液中环氧基可发生二醇化反应： （四）间隔臂 当配基较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基大分子不能发生有效的亲和吸附作用。 这时，需要在配基 与载体之间连接一 个“间隔臂”，使其发 生有效的亲和结合。 间隔臂的作用 间隔臂应满足以下条件： 发生作用的活性位点必须位于配基分子的内部，并且不能影响配基与目标产物结合；长度适当，不能过短，否则难以和配基有效结合，不能太长，以免自身某些基团发生相互作用，同时结合能力下降；必须在某种特定的分离条件下能被洗脱 （五）封闭 活化结束后有少部分活化基团未被配基偶联，需要将其封闭。 可加入过量的能与活化剂反应的试剂封闭多余的活化基团，或水解活化基团。 五、亲和色谱法的操作过程 1.配基固相化（样品制备、装柱、平衡） 2.亲和吸附 3.解吸附 4.色谱柱再生 1.配基固定化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称亲和柱）。 2.亲和吸附（进料和杂质清洗）。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。 3.解吸附（目标产物洗脱）。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来。 4. 色谱柱再生。清洗液清洗。 （一）样品制备 （二）装柱与平衡 （三）吸附：被分离的目标产物与亲和吸附介质紧密结合的过程 （四）清洗：洗去色谱柱中和吸附剂内部未被吸附的杂质，尽可能留下专一性吸附的结合物。 （五）洗脱 1、洗脱方法 特异性洗脱：用能与配基可待分离物质发生更强特异性亲和作用的小分子化合物作为洗脱剂，通过与配基可目标产物竟争性结合，使配基与目标产物解吸的洗脱方式。 特异性洗脱通常在低浓度、中性pH下，条件温和，有利于目标产物的活性。同时有利于提高目标产物的纯度。 例如：Lys和Arg均为t-PA（组织纤溶酶原激活剂）的抑制剂，利用固定化Lys为配基亲和分离t-PA时，可用Arg溶液进行洗脱。 非特异性洗脱：改变洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等物化性质，降低目标产物与配基之间亲和作用的洗脱方法。 比如：目标产物与配基通过静电作用时，可提高离子强度法洗脱。 2、洗脱方式 一步洗脱：针对目标产物与配基高度特异性结合的情况。调节洗脱液的性质，以改变目标产物与配基之间的结合作用，将目标产物一次性洗脱下来，可得到较纯的分离物。 分步洗脱：亲和配基的专一性结合作用较弱，配基上结合了包括目标产物在内的一组结构相似的物质，需要几中不同的洗脱条件分几步洗脱。即先用解吸附作用弱的洗脱液，再用解吸附作用强的洗脱液。可将亲和力不同的成分从配基上分别洗脱下来。 梯度洗脱：利用洗脱液的pH、离子强度等因素的梯度变化，将吸附性质相同、特异性程度不同的物质洗脱下来。 随着洗脱液解吸附能力的逐渐增强，与配基亲和力不同的被吸附物质分别被洗脱下来。效果比分步洗脱要好。 （六）亲和色谱介质的再生与保存 1、再生 去除未被洗脱的仍然结合在亲和介质上的物质，以使亲和柱能反复使用。 2、保存 亲和色谱介质一般保存于溶胀状态，温度4℃-8℃,可加入乙醇或叠氮钠。 三、离子交换剂的理化性能 （一）离子交换树脂的理化性能 1、物理性质 外观：球形、浅色为宜，粒度大小为16-60目;孔度、孔径、比表面积 机械强度：90%； 含水量：0.3-0.7g/g 树脂； 稳定性：热稳定性； 膨胀度：交联度、活性基团的性质与数量、活性离子的性质、介质的性质和浓度、骨架结构； 湿真密度：单位体积湿树脂的重量； 2、交换容量 总交换量：每单位数量树脂能进行离子交换反应的化学基团的总量。 工作交换容量：树脂在某一条件下的离子交换能力。 再生交换容量：一定的再生剂量条件下所取得的再生树脂的交换容量。 再生交换容量为总交换容量的50-90%，工作交换容量为再生交换容量的30-90%。 3、吸附选择性 对阳离子的吸附 对阴离子的吸附 对有色物的吸附 （二）多糖基离子交换剂的理化性能 极大的表面积和多孔结构 良好的化学、物理稳定性 离子交换纤维素适于易变性的生化产品的纯化 分离能力强，能将一组复杂的混合物逐一分开 能分离纯化毫克量的纯品 四、离子交换色谱基本操作 （一）离子交换树脂的操作 1、离子交换树脂的选择 对阴阳离子交换树脂，一般根据被分离物质所带的电荷来决定选用哪种树脂。 被分离物质带正电荷，则采用阳离子交换树脂，被分离物质带负电荷，则采用阴离子交换树脂。 2、对离子交换树脂强弱的选择 目标产物具有较强的碱性和酸性时，宜选用弱酸或弱碱性的树脂，以提高选择性，并便于洗脱。 目标产物是弱酸或