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微生物的显微计数和大小测量 实验目的和内容 a. 了解血球计数板的构造和使用方法，并掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。 b. 学习用显微测微尺测量酵母细胞的大小，使大家对微生物大小有一种直观的认识。 C.学习灭菌技术 实验仪器,材料和用具 实验用具 载玻片、盖片、200μ l移液器及tip、擦镜纸、 装有蒸馏水的洗瓶。 实验仪器 普通生物显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、手动计数器; 菌种 啤酒酵母 实验原理 实验原理 血球计数板的结构 实验原理 实验步骤 稀释： 200rpm,28 ℃, 24h,稀释20倍 将啤酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释. 镜检计数室： 在加样前，先对计数板的计数室进行镜检若有污物，则需清洗后才能进行计数 血球计数板清洗 实验步骤 加样品： 在清洁干燥的血球计数板上盖上盖玻片，再把吸有经稀释并振荡均匀的啤酒酵母菌液的细口滴管对准盖玻片边缘，轻挤滴头，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，让计数室刚好充满菌液。注意不可有气泡 。 每次吸液前都要振荡均匀！ 实验步骤 显微镜计数： 将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜(X40)观察，若酵母细胞只往某一方向流去，表明载物台没有水平，需调水平直到菌液不往某一方向流动为止，注意在显微镜下是“水往高处流”。静置1分钟后进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。 实验步骤 显微镜计数(400x)： 一般样品稀释度要求每中格内有l0～20个菌体为宜。计数时，如用16X25规格的计数板要按对角线方位，取左上，右上，左下，右下四个大格(共4个中格，l00个小格)内的细胞逐一进行计数：如果使用规格为25X16型的计数板，除了取左上，右上，左下，右下四个中格外，还需加数中央的一个中格(共5个大格，80个小格)内的细胞，计数时当遇到中格线上的酵母菌时，一般只计此中格的上方及右方线上的细胞， 而且只计胞体一半以上在线内的细胞. 如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。将各中格的细胞数填入表中，如果各中格的细胞数相差不大，表明菌悬液较均匀，数据可以使用。 酵母菌计数 实验步骤 重复12次实验过程，取其平均值，按下列公式计算每ml菌液中所含的酵母菌细胞数。 计算：16X 25型血球计数板的计算公式： 25X16型血球计数板的计算公式(√)： 实验步骤 清洗血球计数板： 使用完毕后，马上将血球计数板用洗瓶冲洗，可用棉花擦洗，切勿用硬试管刷洗刷，洗完后用蒸馏水冲洗一遍，斜置自行晾干或用滤纸沾干，最后用擦镜纸揩干净。 显微测微尺的使用(1000x)(测20个单个酵母母细胞的长短轴)求平均值 (eg.9.2±0.4um.) 结果与讨论 根据你的实验体会，说明血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？ 显微测微尺上的刻度大小和放大倍数会影响到测量结果吗? 假设酵母菌是标准的椭球体，根据实验结果，试推算酵母菌培养液中酵母菌的体积含量 。 V酵母=4πabc/3(a=b为半短轴，c为半长轴） 准备实验四: 微生物观察与分离 肉汤蛋白胨培养基的配制（按实验指导87页配方琼脂为2％）。300ml/组置500ml三角烧瓶中用封口膜封好瓶口，用记号笔在瓶上标明培养基名称、组号（如周次－座次，1－3－2）、配制时间，121℃灭菌15-20min。 pH7.2-7.6。 包平皿20个/2包/组,高压灭菌。 说明：以上内容全班按组轮流进行配制。实验讲课前倒平板(20个)。 谢谢大家！ * * 1mm 血球计数板是一块比普通载玻片厚得多的玻璃片，其上由四条平行槽构成的三个平台，中间的平台较宽，其中间又被一短槽隔成两半，每边平台上面各刻有一个方格网，即为此计数板的计数室。计数室的长宽各为1 mm，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0.1mm3。计数室有两种规格。一种是16X25型，共有16个大格，每个大格又分为25个小格。另一种是25X16型，共有25个大格，每个大格又分成16个小格。应用血球计数板在显微镜下直接计数微生物细胞的数量，就是先测定若干个方格中的微生物细胞的数量。再换算成每ml菌液中微生物细胞数量。 10X10 40X10 酒精棉球擦洗 擦镜纸擦洗 不要从高处往下滴！ 稀释20X 10X10 40X10 40X10