西尼罗热病毒RT—PCR检测方法的建立.docVIP

西尼罗热病毒RT—PCR检测方法的建立 一 25一 文章编号:1005—944x(2005)05一OO25—03 西尼罗热病毒RT—PCR检测方法的建立 姜焱★张常印陈国强(江苏出入境检验检疫局210001) 摘要:参考Genebank发表的西尼罗热病毒(WestNilevirus,WNV)E糖蛋白基因序列,自行设计合成一对引 物,对WNv进行RT—PCR扩增,产物经琼脂糖电泳分析,呈现一条约400bp的条带,将其克隆入pMD18一T— Vector载体中,并进行序列测定,与已发表的WNV基因比较发现,核苷酸的同源性为99.7%,证实为Ⅵ的E 基因,通过对样品多次检测,都能扩增出一条约4O0bp的条带,表明该方法比较稳定. 关键词:西尼罗热;E基因;RT—PCR;克隆;序列测定 西尼罗热(WestNileFever, WNF)是由西尼罗病毒(westnile virus,Ⅵ)感染引起的一种急性传 染病】.Ⅵ是一种虫媒病毒,黄 病毒科,为40—60nln的20面体立 体对称型单股正链RNA病毒,有囊 膜,与日本乙型脑炎病毒,圣路易脑 炎病毒,墨累河谷脑炎病毒和Kun- jiIl病毒等黄病毒在抗原方面有着 密切的关系.WNv于1937年在乌 干达的西尼罗地区从一位发热妇女 的血液中首次分离到】,20世纪5o 年代在埃及从病人,鸟和蚊子也分 离到病毒b】.Ⅵw~,沿鸟一蚊一 鸟途径在自然界中循环,鸟类是 Ⅵw~,的扩散宿主,蚊子(尤其是库 蚊)是主要的传播媒介,携带西尼罗 病毒的蚊子叮咬人是本病的自然传 染途径[210由引起的是 黄病毒中流行最广的一种疾病,其 分布在非洲和欧亚大陆的许多国 家.一般症状较轻,很少侵犯中枢神 经系统,病死率低.在20世纪90年 代中期之前除1951—1954年和 1957年在以色列及1974年在南非 外,WNF很少暴发流行.20世纪9o 年代中期以后,WNF的暴发范围和 强度明显增加,病情严重,病死率 高.自1994年至今,WNF在北非,中 东,欧洲和北美等地区高速流行, 1999年首次在西半球的美洲国家, 主要是在美国发生流行,并引起马 和鸟类等动物发病死亡[5-121. 西尼罗热确诊有赖于实验室诊 断.血清学检验是最常用的实验室 临床检验方法.由于乙脑等病毒与 西尼罗病毒间存在免疫交叉反应, 因此,进行血清学诊断时,必须结合 病人居住地疫情和有无疫区旅行 史,病人的免疫状况和预防黄病毒 (如乙脑,黄热病等)接种史,病人的 发病及标本采集时间和临床疑似诊 断等情况,依据特异的鉴别试验(如 病毒中和试验)作出确诊[1310西尼 罗病毒的分离对实验条件要求很 高,非一般临床实验室所能进行.以 RT—PCR进行西尼罗病毒RNA检 验是目前最快速,特异,敏感的方 法.本研究通过分析Ⅵ的E基 因,设计并合成了一对引物,通过对 RT—PCR条件的优化及对样品的多 次检测,构建了特异,敏感,快速的 检测WNv的RT—PCR方法. l材料和方法 1.1材料 1.1.1病毒 州购自美国FortDodgeAn- 污物可根据条件和需要,或堆积泥 封发酵后肥田,或加工成饲料,或用 作食用菌的培养基,或制沼气等. 3.3病死畜禽无害化处理 农村散养死亡的畜禽,由于条 件所限和太分散零星,一般很难处 理后再利用.建议利用废弃的水 井,地窖或根据居民居住密集情况, 酌情定点深挖土井,上面盖上水泥 盖等,每有病死畜禽即投入其中后, 撒上石灰,盖上井盖,再定期浇上汽 油,柴油等焚烧,待填至离地平面1 米时,再填土深埋.严禁随意丢弃 和食用病死畜禽,特别是严禁在沟 渠河流内丢弃病死畜禽. 3.4加强集市屠宰场管理 集市屠宰畜禽,一般多是禽类 的宰杀脱毛.可将这些经营户固定 集中于一处,不可到处经营.兽医 卫生管理人员和市场管理人员,可 每天将羽毛,角皮,肠等污物集中消 毒处理,对宰杀场地冲洗干净后,喷 洒消毒.对加工畜禽熟制品的地 点,要对加工废弃物进行无害化处 理,设立废水处理池,对废水处理池 进行无害化处理. 农村的兽医卫生管理,绝不单 单是畜牧兽医部门的工作,这需要 全社会的共同努力.只有在南水北 调工程未实施之前,提前做好兽医 卫生管理工作,搞好沿湖地区的公 共卫生,才能确保南水北调工程的 调水质量,有效控制畜禽或人畜共 患传染病的发生和流行,保证当地 和京津地区人们的身体健康,促进 畜牧业的发展.这不仅是微山湖地 区所应做好的事情,也是整个南水 北调工程沿线地区都应切实关注的 工作. CHINESEJOURNALOFANIMALQUARANTINE2005,22(5)一26— 1.1.4引物设计 参照Genebank公开发表的E 基因序列,自行设计了如下引物,扩 增长度为400bp,引物由上海皓嘉 公司合成. 5一弓I物5一