tfpi-2基因原核表达及重组tfpi-2生物活性分析-prokaryotic expression of tfpi - 2 gene and biological activity analysis of recombinant tfpi - 2.docx

华中科技大学问济医学院 博士学位论文 英文缩写词及中文对照 A absorbance i吸光f交 bp base pair BSA bovine serum albumin OAB diaminobenzidine EB ethidium bromide ECM extracellular matrix 险基对 牛血清白蛋白 二氨基联苯胶 澳化乙昵 细胞外基质 FVII factor VII j疑血因子 VII HRP horseradish peroxidase 辣棍过氧化酶 MMPS matrix metalloproteínases 00 optieaJ density PBS phosphate buffered salin 基质金属蛋白酶 光密度 磷酸盐缓冲液 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链反应 PLg plasminogen PVDF ployvinylidene fluorìde PVPF polyvinypyrrolidone- free polycarbonate filter 纤溶酶原 聚偏二氟乙烯膜 无聚乙烯 n比咯炕酣的 聚碳酸脂滤膜 华中科技大学同济医学院 |呀，士学位论文 rpm revolutions per minute 每分钟转数 SDS.PAGE sodium sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis dodecyl 十二炕基磺酸 饷.聚丙烯瞅版凝胶 Eg泳 TBST trís-buffered Tween 20 saline containíng  含!吐温 20Tris 缓冲盐水 TEMED N，N，N ，N-tetramethylcthylcnediam Ine  N，N，N ，N 咽阴甲主§乙二:1交 TF tissue factor TFPI-2 tissue factor pathway inhibitor 2 组织因子 组织因子途径抑制物之 U-PA urokinase actìvator. type plasminoge  尿激酶型纤溶部原激活剂 2 华.11科技大学问济医学院 啤.i丁学位论文 TFPI-2 基因原核表达及重组 TFPI -2 生物活性研究 博士学位巾请者: 宁勇 博士生导师: 宋善俊教授 华中科技大学同济医学院协和医院血液病研究所 中文摘要 第一部分 人 TF凹-2cDNA 在原核中表达的研究 目的 探索构建人 TFPI..2 基因的原核表达载体及其在大肠杆菌中 有效表达的方法，以获得丰富的具有生物活性的重组 W凹-2 蛋白， 用于基础和临床研究。 方法 以编码人 TFPI-2 蛋白的 cDNA 为模板，加上特殊设计引物 进行 PCR ，在引物设计时将引物中的CfO (Asp) 变成 GGA (Gly). 达到点突变的日，经酶切回收的原核表达载体 pET28a 的 DNA 片 3 华中科技大学同济医学院 博士学位论文 段，与扩增后的目的基因片段连接。将已连接有人 TFPI之基因 DNA 的 pET28a 载体转到 DH5a 菌株中培养 F 取单个菌落做菌落 PCR 鉴 定。 将插入了 TFPI-2 基囚的 pET28a 载体转化大肠杆菌 BL21 株， 以 IPTG 诱导表达，表达产物进行 Western blot 鉴定。 阳性克隆进行大量表达，表达产物经 Ni 亲和层析和透析得到 融合蛋白。 结果 1、成功构建重组TFPI之的原核表达质粒。 2、经Western blot 证实有IFPI-2 融合蛋白的表达。 3、大量表达获得超过800ugIL浓度的 TFPI-2 蛋白 e 结论 人 TFPI之基因在原核中的表达步为 TFPI-2 病理生理作用的 基础和临床研究，提供了丰富的材料。 第二部分 重组 TFPI-2 抑制纤溶酶活性研究 目的 证实非糖基化重组 TFPI之具有抑制纤洛酶的活悦。 方法 应用酶促动力学分析方法，选择 u A 活化 PLg 时， PLg 的 4 华中科技人学同济医学院 博士学价论文 合适底物浓度、温度及时间，建立 TFPI-2 抖l制纤溶酶的测定方法 并进行抑制动力学分析。然后分别测定重组 TFPI-2 对液相和罔相 巾的纤溶酶的抑制作用。 结果 重组 TFPI-2 对液相矛u 罔相中的纤溶酶均有显著抑制作用， 且早，剂量效应关系。 结论 重组 TFPI-2 具有强烈抑制纤溶酶活性的作用，为进