tgf-β1基因修饰的树突状细胞治疗重症肌无力的实验分析-experimental analysis of tgf - β 1 gene modified dendritic cells in the treatment of myasthenia gravis.docx

华中科技大学同济医学院博士学位论文前重瘦肌无力(myasthenìagravis，MG)是一种主要由抗乙曹先??碱受体抗体(anti-acetylcholìnerecepωrantibody，AChRab)介导的、T淋巴细胞依赖性的及补体参与的神经·肌肉接头(neuromuscu1arjunction，N沁，U)处传递障碍的自身免疫性疾病。临床主要表现为部分或全身骨锵肌易于疲劳，呈波动性肌无力量常具有活动后加重、休怠后减轻和建轻暮重等特点。本病是我国一种常见病、难治病，可发生于任何年龄，其发病率为8.._.20/10万，患病率为50/10万。其理想的治疗器标就是特异性地抑制针对乙戳腥碱受体(acetylcholìnerecepωζAChR)的异常免疫反应而不干扰其它的免疫功能。传统的全身免疫抑制治疗虽然可以取得一定的疗效，暂时缓解病情，但不能有效地防止疾病的复发与进展?并且易使意者的免疫系统受到全面抑制而招致严重感染、肿瘤及骨髓抑制等GS都认为tMG的发病主要是针对AChR自身抗原的耐受障碍，活化的T淋巴细胞的局部浸润、AChRab的产生是MG器官特异性损伤的免疫学基础。AChR多克隆的IgG抗体是由外湾淋巴器官、骨髓和胸朦的浆细胞所产生。这些浆细胞来源于B淋巴细胞，后者通过抗原特异性的辅助性T淋巴细胞而活化。因此，AChR特异性的T淋巴细胞是MG特异性治疗购延位。重建AC版的自我跟受F抑制特异性T淋巴细胞的产生，为MG的治疗提供了新的思路。已有实验证实，经过口服或鼻粘膜途径，给予AChR或其某些特异性的放段可以诱导免疫耐受，预防实验性自身兔疫性戴症肌无力(experìmentalautoimmunemyastheniagravis，EAMO)的发生，但并不能治疗EAMG.有效地阻断病情的进展。树突状细胞(dendriticcell，DC)是机体内最强的抗原提里细胞(antigen-presentingcell，APC)，它既可以启动免疫应答，又可以诱导免疫耐受，其生物学功能与其发育成熟的程度有关，并具有可塑性。转化生长因子-?1(transforminggrowthfactor.?1，TGF-(31)可以抑制其成熟，非成熟的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但激活初始T淋巴细胞的能力很弱。采用基因修饰的方法?诱导DC免疫耐受的性能，用于MG的实验研究目前国内外尚未见报道。本研究在成功诱导Lewis大鼠EAMG动物模型和体外培养、基因转染大鼠DC的基础上，观察TGF-?l基因修饰的DC对EAMG病情的影响;并从T淋巴细胞的功能状态及其共剌激通路两方面探讨其可能的作用机制，以期为MO的特异性治疗探索一条新的途径。实验流程图队ChR蛋白的提取与鉴定咱l-\ChR兔疫复制EAMG大鼠DC的体外诱导唱krrOF-?l基因转染及筛选『，基因修饰的DC治疗初发的EAMG③咱v可咱|症状评估|电生理变化INMJ超微病理学改变|电④⑤电w血清AChRab的水平咱，T细胞IFN-y及其受PBMCCTL-A4/CD28:体的表达水平B7的表达水平2TGF-?1基因修饰的树突状细胞治疗重症肌无力的实验研究华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科博士研究生王云甫博士生导师孙圣刚教授中文摘要第一部分实验性重疲肌无力大鼠模型的研究目的从丁氏双鳝电链电器宫提取AChR蛋臼免疫Lewis大鼠，建立EAMG动物模型。方法参照徐氏法从丁氏双错电路电器官摄取AChR蛋白?并采用SDS-聚丙烯酸版凝胶电泳、Folin-盼试剂法及酶联兔疫吸附试验进行初步鉴定:以摄取的蛋臼主动免疫Lewis大鼠，每天观察其临床表现F并于免疫后?周进行低频重复电剌激、血清中AChRab水平的检测及神经幡肌肉接头(neuromuscularjunction，NMJ)的病理学观察。结果.(1)提取蛋白电泳可见41kD、47kD、56kD的三条主要区带，浓缩后蛋白的含量为35.4mglmL;提取蛋臼可以与阳性血清中的AChRab发生结合反应。(2)免疫后:周左右声实验组有3只大鼠出现轻度的肌无力症状?持续2-5d自行缓解，免疫后5周左右实验组8只大鼠均表现出不同程度的肌无力症状:而正常对照组及完全弗氏佐剂(completedFreundtsa司juvant，CFA)对照组均未见异常。(3)实验组大鼠低频重复电剌激限性率达75%，其衰减率明显高于正常对照组(PO.Ol)，而CFA3对照组与正常对照组之间比较无明显差异。(4)实验组大鼠AChRab水平明显高于CFA对照组(PO.Ol);实验组7只大鼠AChRab的PIN值2.1，而CFA对照组PIN值均1.40(5)实验组大鼠NMJ处与伽银环蛇毒素结合的AChR减少，突触后膜皱擂减少，突触间隙增宽。结论从了氏双鳝电路电器官提取的AChR蛋白可以