使用腺病毒过表达txnip对h9c2心肌细胞损伤和凋亡影响-生理学专业论文.docxVIP

使用腺病毒过表达 TXNIP 对 H9C2 心肌细胞损伤和凋亡的影响摘要研究背景：近年来，全球糖尿病的发病率、死亡率明显上升，已成为威胁人类健康与 寿命的最重要疾病之一。糖尿病（Diabetes Mellitus）是由遗传和环境等因素引 起胰岛素绝对或相对不足，导致糖、脂肪、蛋白质代谢异常，而以慢性高血糖 为主要表现的一组临床综合征。除引起糖脂代谢的紊乱外，糖尿病可引起心、 肾、脑等多个器官的合并症，其中以心脏并发症最为危险，是导致糖尿病人死 亡的最主要原因。本实验室前期的研究显示，无论是高糖高脂喂养结合链脲佐菌素注射造成 的慢性 2 型糖尿病大鼠模型，还是高糖高脂刺激的培养心肌细胞，均观察到明 显的心肌细胞损伤和凋亡，其机制与高糖高脂刺激引起硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)的活性下降有关，而硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein, TXNIP)的表达明显上调，是糖尿病引起 Trx 功能下降的重要原因。TXNIP 是目前发现的唯一一种内源性的 Trx 结合抑制蛋白，在肿瘤、糖尿 病等疾病中发挥作用。本实验室之前在高糖高脂喂养结合小剂量链脲佐菌素注 射制备的 2 型糖尿病模型和高糖高脂刺激的培养成鼠心肌细胞上都发现 了 TXNIP 表达的显著增加，而且是糖尿病时 Trx 系统相关各蛋白中变化最明显的 一个，同时观察到糖尿病或高糖高脂刺激引起了心肌细胞的损伤和凋亡。但 是 TXNIP 的上调仅仅是糖尿病时一种继发的伴随性变化，还是本身参与了糖尿病 细胞损伤的发生，尚不清楚。为分析此问题，我们前期构建了 TXNIP 的干扰质 粒并转染培养的 H9C2 细胞，观察抑制高糖高脂引起的 TXNIP 表达，是否可以 减轻心肌细胞的损伤和凋亡。结果表明，使用 RNA 干扰技术减弱 TXNIP 的上调后，高糖高脂刺激引起的心肌细胞损伤和细胞凋亡减轻，Trx 的活性显著提高，可以证明 TXNIP 的上调是糖尿病引起心肌细胞损伤的重要环节。 考虑到前述研究均是在糖尿病或模拟条件下的观察，研究 TXNIP 的作用时仍不能排除高糖高脂的直接或 TXNIP 以外的损伤途径，因此，为进一步 明确 TXNIP 的表达升高本身是否足以引起心肌细胞损伤的发生设计了本实验，采用 腺病毒转染培养的 H9C2 细胞，使心肌细胞过表达 TXNIP，观察单纯 TXNIP 增 多对正常糖脂培养条件下心肌细胞损伤和凋亡的影响，并 对其损伤机制进行了 简要分析。目的：运用病毒转染技术，使心肌细胞过表达 TXNIP，以观察正常培养条件下细 胞单纯过表达 TXNIP 是否可以引起心肌细胞凋亡，并对其机制进行分析，以明 确 TXNIP 在糖尿病心肌细胞凋亡中的作用及其途径。方法：1.使用腺病毒转染技术使心肌细胞过表达 TXNIP使用处在对数生长期的 H9C2 细胞，细胞随机分为 3 组，即：正常培养组、 不含目的基因的腺病毒对照组（Ad-eGFP 组）、TXNIP 过表达（Ad-TXNIP-eGFP） 组；在转染前一天分别换液处理，第二天进行转染， 病毒滴度按每个细胞 100 个病毒颗粒计算。4 h 后补加含 10%胎牛血清的 DMEM 继续培养，24 h 后换液 处理，继续培养至 72 h，中间观察病毒转染效率。2.确定转染效率利用荧光倒置显微镜拍摄同一个视野下的转染细胞，计算同一个视野下带 绿色荧光蛋白细胞占整个视野下所有细胞的百分比计算转染效率。同时使 用 Real-time PCR 方法测定转染 H9C2 心肌细胞 TXNIP 的 mRNA 表达。3.分析 TXNIP 在心肌细胞损伤和凋亡中的作用通过前两部分实验，确定转染率相对最高的时间点，分别收集各组培养细胞核培养基，测定乳酸脱氢酶（LDH）活性、丙二醛（MDA）和 3-硝基酪氨酸含量、p38 激酶、caspase-3 及 Trx 活性,并用流式细胞术检测细胞凋亡率， 用western blot 方法分别测 TXNIP 和 Trx 蛋白的表达量。结果：1.转染效率1.1 荧光显微镜观察转染效率镜下观察转染成功，24 h、48 h、72 h 转染效率分别为：9.94％±1.12％、68.50％±4.57％、88.86％±3.23％，其中转染 72 h 的转染效率显著高于转染 24 h(P0.01)和转染 48 h(P0.01)，因此该部分实验我们选择转染 72 h 的细胞做后续实验分析（图 1）。1.2Real-time PCR 方法测定转染 H9C2 心肌细胞 TXNIP 的 mRNA 表达 与正常培养组相比，Ad-eGFP 组细胞 TXNIP 的 mRNA 无显著性变化（mRNA0.99±0.13 vs.1.08±0.26; P0.05），TXN