不同环境样品中副溶血性弧菌毒力基因表达差异分析及副溶血性弧菌活菌定量方法的建立-differential analysis of virulence gene expression of vibrio parahaemolyticus in different environmental samples and establishment of a quantitative method for vibrio parahaemolyticu.docxVIP

及不可培养细胞，这样会使我们过高或错误的估计样品所存在的风险。随之产生的反转录荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，采用mRNA模板来取代DNA模板，可很大程度上降低活菌检测中的假阳性结果出现的概率，得到更准确可靠的检测结果。所以，本研究建立了一种基于RNA技术的副溶血性弧菌的活菌检测方法。实验结果表明：1、目前针对于食品样品中微生物总RNA的提取尚无一个成熟的方法，是后续相关分析的一大难点。因此我们首先对虾样品中副溶血性弧菌总RNA提取条件进行了优化，设置了两种细胞恢复溶液：0.85%生理盐水和0.1%蛋白胨溶液，以及两种均质方法，均质器匀浆和晃动均质，恢复溶液和均质方法亮亮组合进行提取效果的对比。结果显示晃动均质以及0.85%生理盐水组合提取的方法，能够从虾样品中提取得到较高纯度和完整性的副溶血性弧菌总RNA，可供后续基因表达分析实验使用。2、采用geNorm软件计算并分析了相关文献中已发表的4种副溶血性弧菌管家基因的表达稳定性，表达稳定性排列顺序为pvuApvsAGAPDHrpoS，再经过最优内参基因数目评价，确定了以pvuA和pvsA两个基因的几何平均值作为参照可更为准确地校正目的基因的表达。结果证明pvuA和pvsA基因可作为环境样品中副溶血性弧菌毒力基因表达变化研究的内参基因。3、采用qRT-PCR方法对5株菌在不同温度的海水、过滤海水及虾样品中毒力基因的表达变化情况进