第5讲__目的基因的克隆与分离.ppt

第一讲 基因工程概论 第二讲 基因工程的主要技术 第三讲 基因工程的酶学基础 第四讲 基因克隆的载体与受体 第五讲 目的基因的克隆与分离 第六讲 克隆基因的检测与功能鉴定 第七讲 克隆基因的表达与产物纯化 第八讲 基因表达的调控 将重组分子包装成病毒颗粒，然后感染大肠杆菌，高效地将重组分子导入到细菌中繁殖。 包装蛋白系统由动能互补的A、E两种蛋白构成，在E蛋白存在条件下，噬菌体头部蛋白先形成空的前头部结构，由A蛋白识别λ基因组的cos序列，如果两cos序列间的分子大小为野生λ基因组大小的75%-105%，A蛋白能发挥内切核酸酶的作用，使cos序列切割成１２碱基的黏性尾并将分子纳入到头部结构中。 尾部结构可在尾部蛋白分子间自组装，再与成熟的头部结构结合，形成完整的噬菌体颗粒。 重组噬菌体形成的包装后的混合物即所谓的基因组文库的原库，可以用少部分感染大肠杆菌细胞以确定文库感染的效价。 保存噬菌体：在包装物中加１～２滴氯仿抑制细菌的繁殖，在４℃冰箱中保存。 噬菌体的效价指每毫升培养液中所含活噬菌体的数量。 采用双层琼脂平板法。 文库的完整性：应包含基因组的完整序列信息； 基因组信息的可重建性：随机性片段使染色体DNA相邻序列的克隆重组子具有重叠性，可以通过建立叠连群而重建完整序列信息； 文库的大小：文库中应包含的独立重组子数目； 重组克隆的总数不宜过大：减轻筛选目标克隆的工作量 克隆片段大于研究基因的平均长度：以便筛选到完全的单一基因； 含有相邻DNA片段的独立克隆间，部分序列重叠的大小合理； 克隆片段易于从载体分子上完整卸下且最好不带有任何载体序列； 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。 同一种内切酶消化时，可产生相同黏性末端， 当带有相同黏性末端的DNA片段在一起退火，在DNA连接酶的催化作用下黏性末端的单链之间便可进行碱基配对，被共价地连接起来形成重组DNA分子。 结果：目的基因的正反向插入、载体或目的基因片段会自身环化、载体与单个或多个目的基因片段之间重组等，其中载体的自身环化最为常见。 一般采用提高连接反应体系中目的基因对载体的比例，或用碱性磷酸酶对载体进行脱磷酸处理，以阻止线性载体DNA分子自身环化。 用两种限制性内切酶消化载体DNA和外源DNA片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组DNA分子，从而实现DNA的定向连接。 转化 transformation 转染 transfection 转导 感受态细胞： 处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞。 操作周期长，转化效率受到原生质再生率的严重制约； 显著特点：一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子 不需要消化酵母的细胞壁；转化效率较原生质体法低 转化率是每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数，是衡量转化效率的重要指标。 转化率的定义：每微克载体DNA转化后，接纳DNA分子的受体细胞个数，即阳性克隆数。 统计每个培养皿中的菌落数。 转化子总数=菌落数Χ稀释倍数Χ转化反应原液总体积/涂板菌液体积 转化频率=转化子总数/质粒DNA加入量 感受态细胞总数=对照组的菌落数Χ稀释倍数Χ菌液总体积/涂板菌液体积 感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数 载体和外源DNA 的量； 涂布多少平板 载体DNA及目标DNA重组 受体细胞 转化方法 载体本身的性质决定了转化率的高低，不同的载体转化同一受体细胞，转化率不同。 一般规律：小分子质量的质粒，转化率高；大质粒通常转化率低。 质粒与受体细胞的亲和性也可影响转化。 亲和性强的质粒转化效率高于亲和性弱的质粒。 载体的空间构象对转化率有明显影响，超螺旋构象的质粒具有较高的转化率。 重组DNA的浓度和纯度对转化率也有影响，在10ng/100ul以下的DNA浓度范围内，转化效率与DNA数量成正比关系 受体细胞必须与载体相匹配： pBR322转化大肠杆菌JM83，转化率很低，但对大肠杆菌ED8767的转化率较高。 不同的转化方法，转化效率也有差异： 电穿孔法的转化率最高；其次是Ca2+ 诱导法；而接合转化法最低。 在同一种转化方法中，不同的技术参数下其转化效率也有所差异。 打算将一个cDNA克隆到一个表达载体，以便在大肠杆菌中大量制备相应的蛋白质。 这个cDNA的两侧具有BamHⅠ位点，因此计划它从BamHⅠ的位点插入载体中。 实验严格按照克隆手册中的方法进行：载体用BamHⅠ切割后，立即用碱性磷酸酶处理除去5‘磷酸； 接着将处理过的载体同用BamHⅠ切割后的cDNA片段混合，加入DNA连接酶后进行温育，连接后，将DNA同已处理过的可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。 最后，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载