细胞电生理学与 膜_片 钳技术.ppt

内面向外膜片(inside-out patch) 在细胞吸附模式高阻封接形成后,将微管电极提起,使吸附的膜片从胞体上被切割下来，就得到“内面向外”膜片。此种模式，可直接且自由地经浴液介导而调控细胞内液的条件，并可在和细胞活动无关的形式下观察到单一离子通道的活动。但是，由于胞质渗漏，可能丢失某种通道调控因子，离子通道活动出现run-down （或run-up）现象。 * 全细胞记录式(Ｗhole-cell recording) 在细胞吸附模式下继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂,电极胞内液与胞内液直接相通,而与浴槽液绝缘,这种形式记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。它既可记录膜电位又可记录膜电流。其中膜电位可在电流钳情况下记录,或将玻管连到标准高阻微电极放大器上记录。 * 外面向外膜片(outside-out patch) 在全细胞模式上将微管电极向上提起,可得到切割分离的膜片，断端游离部分自行融合成脂质双层,此时高阻封接仍然存在。而膜外侧面接触浴槽液。用这种模式，可自由改变细胞外液的情况下，记录单一离子通道的电流活动。 * 开放细胞吸附膜内面向外模式（open cell-attached inside-out mode） 将细胞吸附式的膜片以外的某部位的胞膜进行机械地破坏，经破坏孔调控细胞内液，并在细胞吸附状态下进行内面向外的单一离子通道记录。这种方法的细胞体积越大，破坏部位离被吸附膜片越远或破坏孔越小，都可导致细胞因子外流变慢。 * 穿孔膜片模式（perforated patch mode） 为克服全细胞模式的胞质渗漏问题，Horn和Marty将与离子亲和的制霉菌素（或二性霉素Ｂ）经膜片微电极灌流到含类甾醇的细胞膜片上，形成只允许一价离子通过的孔，用此法在膜片上做很多导电性孔道借此对全细胞膜电流进行记录。因为此模式的胞质渗漏极为缓慢，局部串联阻抗较全细胞模式高，所以钳制速度很慢，故也称为缓慢全细胞模式。 * 穿孔囊泡膜外面向外模式(perforated vesicle outside-out mode) 穿孔膜片模式将电极向上提起，便在微电极尖端处形成一个膜囊泡（膜内面向外膜片断端融合封闭而成）。如果条件较好，此膜囊泡内不仅有细胞质因子还可有线粒体等细胞器存在。所以在有比较接近正常的细胞内信号传递条件和代谢条件的基础上，可能记录到膜外面向外模式的单一离子通道。 * 过去认为，膜片钳只能在培养细胞或酶解的细胞上进行，这样得到的细胞膜表面比较光滑，才能够形成高阻封接，但缺点是组织的正常三维结构被破坏，并且对神经中枢内突触特有的传递机能的研究无法展开。于是，一些学者建立了组织切片膜片钳技术（Slice patch），就能在哺乳动物脑片制备上做全细胞记录。 组织切片膜片钳技术（Slice patch） * 1992年，在脑片膜片钳技术上，美国Ferster 实验室首次报道在在体猫的视皮层用膜片钳全细胞记录研究了视刺激诱发的兴奋性和抑制性突触后电位相互影响及节律性膜电位的变化规律。 * 1993年，德国的Dodt和Sakmann合作，利用红外电视显微镜监视，使得膜片钳记录不但能够在神经元胞体及其树突上进行，而且可同时在这两个不同的部位作膜片钳记录。 * 为研究化学门控性通道性质，我国学者秦达意采用 oil-gate concentration jump method，配合膜片钳记录和分析离子通道在各种化学条件下的开放与关闭以及激活与失活的动态过程。 * 膜片钳技术的应用 分辨单通道电流,直接观察通道的开闭过程; 区分离子通道的离子选择性及其门控特性(如区分电压、化学或门控性通道),发现新的离子通道及亚型; 在记录单个通道电流(ｉ)和全细胞电流(Ｉ)的基础上,可分别计算出细胞膜上的通道数(ｎ)和开方概率(ｐ),依公式Ｉ=ｎｉｐ; * 用以检测某些递质能否打开通道(外面向外膜片),或是否接受第二信使的调控(内面向外膜片); 研究腺苷酸环化酶、多磷酸磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶Ｃ等活性变化,以及细胞膜上信使物质二酰甘油花生四烯酸等对离子通道型受体的调节机制(应用全细胞钳或外面向外膜片); 研究受体的激活态、失活态和静息态的功能； * 研究不同离子强度对通道特性的影响及细胞内信使物质如1,4,5-三磷酸肌醇、环腺苷酸(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、Ca2+等对离子通道型受体的调节机制(内面向外膜片)。 研究药物对电压和化学内控性通道的影响。 * Neher等首创将膜片钳技术与Fura 2 荧光测钙技术结合,同时进行如细胞内荧光强度、细胞膜离子通道电流及细胞膜电容等多指标变化的快速交替测定,这样便可得出同一事件过程中,多种因素各自的变化情况,进而可分析这些变化间的相互关系。 Neher将可光解出钙离子的钙螯合物引入膜片钳技术,