博莱霉素刺激大鼠肺泡巨噬细胞对kv1.3和kv1.5通道mrna与蛋白表达的影响-effects of bleomycin on expression of kv 1.3 and kv 1.5 channel mrna and protein in alveolar macrophages of rats.docxVIP

引言肺纤维化（Pulmonaryfibrosis）是一种慢性炎症性肺部疾病，临床上病情一般呈现进行性发展，最终可导致呼吸衰竭，影响患者生活质量甚至严重危害生命。传统的认识将病变过程分为肺泡的免疫炎症反应、肺实质受损及受损肺泡修复纤维化等环节，涉及到多种炎性细胞、细胞因子、细胞外基质等。慢性炎症是其最基本的病理基础。肺泡巨噬细胞（Alveolarmacrophages,AMs）分布在肺间质，作为吞噬细胞为下呼吸道抵御病原体入侵提供了第一道防线。它除行使吞噬杀病原微生物的功能外，还能对刺激反应性分泌多种化学介质，因此AMs在调节肺部炎症方面有重要作用。目前对AMs的认识是AMs被激活后在局部释放多种化学活性因子，可直接或间接（如趋化中性粒细胞）引起肺泡炎并破坏肺泡壁，而且炎症还可能继发特异性免疫反应使损伤作用扩大化。修复和纤维化过程在肺损伤的同时也在进行。随着对肺纤维化发病机制的各项研究不断深入，我们有必要在“炎症机制”的基础上进一步探讨其它可能的机制。电压门控性钾通道（Voltage-gatedpotassium,Kv）是钾离子通道家族中的一大类快速激活性钾离子选择性通道。其中人Kv通道有40余种，包括10余种亚群，Kv1-Kv12。其结构和功能特点各异，分布广泛，在可兴奋细胞和非可兴奋细胞中均有表达。Kv通道与巨噬细胞的激活、增生、迁移、吞噬等功能有关。更有研究证实Kv1.3与Kv1.5通道在AMs上都有功能性表达，且与上述各种细胞功能有关。[i,ii,iii,iv]Kv通道家族在人体组织有广泛表达，与多种系统的疾病相关。以往有关Kv通道在呼吸系统疾病方面的研究主要集中在肺动脉高压。在肺纤维化方面对囊性纤维化的上皮细胞的研究相对较多，而对AMs的研究少有报道。本研究选用大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383细胞为对象，以博莱霉素为细胞纤维化炎症造模试剂，采用实时PCR和Westernblot两种方法，检测了Kv1.3和Kv1.5通道在mRNA及蛋白水平是否在NR8383细胞有表达、在不同浓度博莱霉素刺激下的表达情况和地塞米松干预后的表达情况，初步探讨AMs的Kv通道与肺纤维化的相关性。材料和方法1细胞培养1.1培养方法[材料]大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383细胞购自中科院上海细胞库；培养液为Kaighnsmodifiedmedium(F12-KNutrientMixture)，胎牛血清(FBS)（货号：SV30087.02，批号：NUF0172）均购自HyClone公司；青链双抗粉剂购自武汉博士德生物公司。[方法]NR8383细胞培养于含20%FBS的F12K培养基中。培养基使用前均已行无菌试验。培养基中青霉素与链霉素终浓度分别为100U/ml、100μg/ml。将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养，采用离心法每3-4天传代一次。1.2细胞计数[目的]了解细胞生长周期、观察生长状况、进行处理前的细胞定量等。[材料]16格*25格血球计数板、盖玻片、100μl和1000μl的微量移液器和枪头、EP管、吸水纸、显微镜、95%乙醇、无菌PBS液[步骤]（1）准备计数板：用95%乙醇液清洁计数板及盖玻片后晾拭干。（2）制备细胞悬液：吹打细胞液，用无菌PBS液稀释n倍成为单细胞悬液（以4-5/格最佳，细胞密度不低于104个/mL）。（3）加样：轻轻吹打悬液后取少许在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液（液体不要溢出玻片也不能溢入玻璃槽内，也不要过少或带气泡）。（4）计数：静置片刻使细胞沉降不再漂动。将计数板置于显微镜上夹稳。先于低倍镜下找到计数区，再转换高倍镜观察并计数（观察时应减弱光照强度）。计数方法：细胞压线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。（5）计算：细胞密度=4大格细胞总数/4*10000*稀释倍数n经计算培养3-4天的对数生长期NR8383细胞密度为(5–10)*105/ml细胞密度换算：C1*V1=C2*V2（C1、V1为稀释前的浓度和体积；C2、V2为稀释后的浓度和体积。）2细胞分组与处理2.1[材料]博莱霉素（bleomycin,BLM）产于浙江海正药业股份有限公司；地塞米松磷酸钠注射液(dexamethasonesodiumphosphateinjection,DEX)产于湖北天药药业股份有限公司；均购自同济医学院附属协和医院。2.2实验一：不同浓度博莱霉素对NR8383细胞的刺激有文献报道用BLM处理正常人原代肺泡巨噬细胞24小时，在一定浓度范围内(0.5-100mU/ml)，细胞吞噬功能的递减和分泌细胞因子IL-1β的增多呈药物浓度依赖性。[v}本实验选取0.1-100mU/ml为BLM药物实验范围，以10倍为梯度检测BLM对NR8383细胞上Kv1.3与Kv1.5通道的表达情况。分组按BLM的终浓度分组，生理盐水组