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亲和色谱 高效分离纯化蛋白质的方法。 原理：不同蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入色谱柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过色谱柱时，该蛋白质与配基发生特异性结合而被吸附在色谱柱上，其他蛋白质流出柱外。被特异结合的蛋白质用适当配体洗脱液洗脱。 根据吸附性质不同- 亲和色谱 常用配基： 抗体、抗原、激素、受体蛋白 色谱柱载体： 琼脂糖凝胶 蛋白质结构 一级结构、二级结构、三级结构和四级结构 多肽链氨基酸顺序分析 蛋白质的结构 蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊方式组合而成。当多肽的分子量大到足够具有一定的空间结构时就称为蛋白质。 蛋白质与多肽的主要差别： 分子量，空间结构 蛋白质结构 一级结构 三维结构 蛋白质的一级结构（primary structure） 1．定义： 蛋白质的一级结构包括组成蛋白质的多肽链数目、多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。 蛋白质氨基酸顺序的改变，不仅影响蛋白质的高级结构，而且将直接影响其生理功能。 蛋白质一级结构—氨基酸顺序 镰形细胞贫血的遗传性疾病，特征是病者的血红蛋白发生变异。 变异的血红蛋白与正常的血红蛋白差异是在一条多肽链上第6位的Glu被Val替代。由于Glu与Val在形成氢键上的差异很大，变异蛋白质的空间结构变化显著，水溶性降低，血液粘度增大，导致贫血症状。 蛋白质氨基酸顺序的改变会引起异常功能或病变。 2．蛋白质一级结构的测定 胰岛素的一级结构 1952年英国生化学家Sanger首次测定 结构特点： 1. 由51个氨基酸残基组成 2. 分两条链： A链：21个氨基酸残基 , B链：30个氨基酸残基 3. 含三个二硫链： 一个A链内的二硫键,两个链间二硫键 蛋白质一级结构的测定步骤 1.肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的量与蛋白质相对分子质量之间的关系,确定多肽链的数目. 2.多肽链的拆分:加入盐酸胍,解离非共价力,过氧酸氧化或巯基还原法拆分二硫键. 4.测定多肽链氨基酸顺序 3.测定多肽链氨基酸组成:酸水解,测定计算各种氨基酸分子比. 多肽链氨基酸顺序分析 1.多肽链的选择性降解 酶解法: 胰蛋白酶 化学法: CNBr水解 2.多肽链末端氨基酸的测定 二硝基氟苯(DNFB)法: N端 丹磺酰氯法:N端 阱解法:C端 3.Edman氨基酸顺序法: N端 酶解法 带正电荷的氨基酸 R1-Lys-Ala-R2 R1-Lys-COO- + NH3+-Ala-R2 胰蛋白酶 Rm Rn Rn 预测端基氨基酸类型 思考题 用胰蛋白酶处理下列小肽，会断裂成什么样的肽片断？ Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Arg-Ser-Gly 答案 Ala-Ser-Thr-Lys Gly-Arg Ser-Gly 思考题 今有一个九肽，分别用（1）胰蛋白酶（2）胰凝乳蛋白酶（3）羧肽酶（4）溴化氰处理，试用箭头及号码表示出它们对肽键作用的位置。 Leu-Met-Arg-Pro-Ala-Lys-Tyr-Ser-Arg 化学方法 溴化氰（CNBr）水解法: 选择性地切割由甲硫氨酸(Met)形成的肽键 高丝氨酸内酯 思考题 一个肽用CNBr切成两个小肽段，又用胰蛋白酶切成另外两个小肽段。 CNBr1, Gly-Thr-Lys-Ala-Glu CNBr2, Ser-Met 胰蛋白酶1, Ser-Met-Gly-Thr-Lys 胰蛋白酶2, Ala-Glu 推断该多肽的氨基酸顺序. 答案 Ser-Met-Gly-Thr-Lys-Ala-Glu 末端氨基酸分析： 包括N端分析，C端分析 N端分析方法 二硝基氟苯（DNFB)法 DNP-氨基酸（黄色） 酸性水解 * 根据三原色原理叠加后的单色形成了第三种颜色并脱离了原本的单色颜色更加丰富象征着产品在原有空间的组合中产生了突破性的变化 * 蛋白质 蛋白质的分类和性质 蛋白质的分离和纯化 蛋白质的结构 蛋白质的分离和纯化 蛋白质的分离 蛋白质的纯化 重点掌握—— 蛋白质分离纯化的基本方法 蛋白质的分离 （一）细胞破碎： 研磨、超声、冻融、酶解等方法。 （二）抽提 根据蛋