第二章兰州大学基因工程基因工程酶学基础.ppt

第六节 单链DNA内切酶 基因突变 * * (a)用5`末端特异的核酸内切酶处理DNA片段A和B，形成了延伸末端， (b)对片段A和B分别加入dATP和dTTP以及共同的末端脱氧核苷酰转移酶，各自形成poly(dA)和poly(dT)尾巴； ?混合退火，通过poly(dA)和poly(dT)之间的互补配对，形成重组体分子； (d) 转化大肠杆菌挑选重组体克隆 * 衔接物的5`末端和待克隆的DNA片段5`末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子， * 由人工合成一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子 * 在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5`-3`核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。 当外切酶活性从缺口的5`一侧移去一个核苷酸之后，聚合作用就会在缺口的3`一侧补上一个新的核苷酸。但由于PolI不能够在3`-OH和5`-P之间形成一个键，因此随着反应的进行，5`一侧的核苷酸不断地被移去，3`一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动。这种移动特称为缺口转移 * 1、DNA聚合酶I反应条件 用途－ DNA杂交探针的制备 缺口转移(nick translation) 2、Klenow 酶 用途 3、T4 DNA 聚合酶 T4 DNA 聚合酶用途 4、逆转录酶 Taq DNA聚合酶 1. 特点： 分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75℃， 对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性 2. 用途 DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4×106倍 DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应，包括以下三个步骤： DNA模板变性(95℃) → 与DNA引物退火(45℃) → 引物延伸(72℃) Taq Pol 和PCR 5’ 3’ 变性 3’ 5’ 5’ 3’ 引物 3’ 5’ 复性 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 引物 3’ 5’ 5’ 3’ 延伸 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 第五节 核酸修饰酶 限制性内切酶反应的终止 终止后直接电泳检测酶切结果 完全消化和部分消化 完全消化 部分消化 双酶切的方法 ①??先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl等金属离子及第二种酶，继续温育 ②?使用适合于大多数限制酶的单种缓冲液--谷氨酸钾缓冲液(KGB)，可使各种限制酶的活性达到较高 使用限制酶的注意事项 第二节 甲基化酶 特征：与限制性内切酶相对应，识别位点相同 1. 大肠杆菌中的甲基化酶 （1）Dam（腺嘌呤甲基化酶） :此酶可在5`GATC3`序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有5`GATC3`的限制性内切酶不能切割 如BclI（TGATCA） （2）Dcm（胞嘧啶甲基化酶）: 此酶在序列5CCAGG3或5CCTGG3中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoRII 2. 甲基化酶的用途 就许多II类限制性内切酶而言，都相应存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使其免受切割 甲基化酶的用途是在必要时可以封闭某一限制性内切酶的酶切位点,同时又可能产生新的酶位点 如两个串联的TaqI识别位点经M．TaqI甲基化封闭后，出现了一个依赖于甲基化的限制性核酸内切酶DpnI的切割位点(下图) 第三节 连接酶 广泛存在于