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厚生科学研究費補助金（特定疾患調査研究事業）分担報告研究コラーゲン誘発性関節炎マウスに対するjunD遺伝子療法主任研究者 鈴木　登　（聖マリアンナ医大　免疫学?病害動物学）関節リウマチでは関節病変部において滑膜細胞が異常に増殖し過剰な炎症性サイトカインを産生する。この過程には転写因子AP-1が重要な役割を果たす。我々はこのAP-1活性を制御するjunD遺伝子をRA滑膜細胞株に導入することによって細胞増殖、炎症性サイトカインおよび蛋白分解酵素の産生が抑制されることを報告した。昨年度はその知見に基き、junD遺伝子発現ベクター、pRSV-junDをコラーゲン誘発性関節炎モデルマウスに投与し抗炎症作用を認めた。本年度はjunD遺伝子発現ベクター投与が関節炎モデルマウスの炎症性サイトカイン産生と滑膜細胞の増殖を評価した。junD遺伝子発現ベクターは炎症性サイトカイン産生と滑膜細胞の過剰増殖を抑制し、直接滑膜細胞の機能を制御することにより、滑膜炎症の抑制をもたらすことが示された。今後患者への臨床応用に向けた検討が必要である。A.研究目的　関節リウマチ(rheumatoid arthritis:RA)は関節病変を主座とする慢性炎症疾患で、自己免疫応答を伴う。異常増殖した滑膜細胞や浸潤リンパ球は炎症性サイトカインや蛋白分解酵素を産生し病態を形成する。RAにおける滑膜細胞の増殖および異常活性には転写因子AP-1が関与する。AP-1はc-Fos がc-Junと二量体を形成することで転写因子としての活性を発揮するが、同じくJunファミリーに属するJunDはむしろ転写活性の制御に作用する。我々はこの点に着目し、in vitroにおいてRA滑膜細胞株にjunD遺伝子を導入すると、細胞増殖、炎症性サイトカインおよび蛋白分解酵素の産生が抑制されることを見出した。本研究ではこの知見を応用し、コラーゲン誘発性関節炎モデルマウスにjunD遺伝子を投与し、その治療効果を検討した。B. 研究方法①コラーゲン誘発性関節炎モデルマウスの作成：DBA1J(6週令雌)に牛II型コラーゲン100 ?gを完全フロイトアジュバントとともに尾根部皮内に投与し、3週後に同様の追加免疫を行い、関節炎を誘導した。②junD遺伝子発現ベクターの作成：マウスjunD cDNAをpRSVベクターに挿入し、真核細胞系発現ベクターpRSV-junDを構築した。③junD遺伝子治療：コラーゲン誘発性関節炎モデルマウス作成過程の免疫前後、すなわち免疫前24時間、免疫後24時間および72時間に20 ?gのpRSV-catあるいはpRSV-junDを筋肉内投与した。④関節炎の評価：四肢関節の腫脹を肉眼的に評価した。各肢ごと全く変化のないものを0点とし、1指の腫脹を１点、2指以上の腫脹あるいは足全体の僅かな浮腫を2点、足全体の激しい腫脹を3点と評価し、四肢関節の点数の合計（12点満点）を関節炎スコアとした。⑤血清IgG型抗II型コラーゲン抗体の測定：96ウェルELISA プレートを0.05M Tris-buffered salineに溶解したウシII型コラーゲン10 ?g/mlでコートし、ブロッキング後、1% BSA 0.05% Tween20 PBS(-)で希釈した血清、HRP標識抗マウスIgGを順次反応させ、TMBによる発色を吸光光度計（450 nm）により測定した。抗体力価は任意のプラスミド非投与コラーゲン誘発性関節炎を発症したマウスの初回免疫より7週目の血清を標準血清とし、arbitrary unitで表した。⑥組織学的検討：各マウスの膝関節をホルマリン固定後EDTAにて脱灰した。薄切後HE染色を行った。一部では免疫染色を行った。（倫理面への配慮）　動物実験では実験前の飼育から実験後にいたるまで科学的?倫理的に対処し動物の苦痛を排除するため麻酔や安楽死などの手法を用いた。組換えDNAおよび遺伝子導入動物は適当と判断される物理的封じ込め方法を採用した。すべての実験は学内IRBの承認のもと、その規則にしたがい施行した。C.研究結果①junD遺伝子投与のマウス関節炎の発症率に与える影響：いずれかの関節の腫脹が初めて観察された時点を発症と定義した。II型コラーゲンの免疫のみでプラスミドを投与しないコントロール群のマウスでは、初回免疫より7週目より関節炎の発症が観察され10週目で83%、13週目で100%に達した。コントロールプラスミドpRSV-cat投与群の発症率は10週目で91%、13週で100%であった。pRSV-junD投与群の発症率は10週目で80%、13週で90%で、junD遺伝子の投与により関節炎の発症はやや低下した印象があるものの有意な影響は与えなかった。②JunD遺伝子投与のマウス関節炎ス