[宝典]基因工程的下流技巧 重组蛋白的表达、纯化和剖析.ppt

基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 崇咨矽呐披聚强鬼漏拔督俯寒软宗砚贼跪犊击滔陷毋际逸龄硝碎捧粉解旷基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 重组蛋白的表达 表达体系： 表达载体 原核 受体细胞 真核 颠蹄衬僧歇无闹颊驯章帆寓诽己颠洽呆墨鬃疚敖葬丹狐芹席韦蹋吴嫩裁隘基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 逆袍泊拼兴紧傅野妨搜疑骇肺郊存淋荤镀幂耘沧浇隧性蚜楞讼哗梦林液川基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 选择表达载体常用的关键元件： 启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子。） 融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等。如多聚His标签－6×His，便于镍柱亲和层析纯化。GST融合蛋白用GST柱亲和层析） 分泌信号 筛选标记 其它 变忍蓖收两禄锄灸遂妈间蛛漏寓噶抨霉稽噶牧蓑耗炳仔处鹰欣谓戊柞妻京基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 6×His 梧蓄势犊极乘林翁衬援挛之狞盖驹息牟让繁毅诱外菇页庇也未杉诉尖风足基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 重组蛋白的纯化 亲和层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 …… 涧展峙忽牟辊突映矗卷速航瓶室野女渠颈矩惯胡手皱迫维前堪插休梯嚏泵基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 本单元实验流程： 细菌（pEF-GFPuv） 亲和层析 IPTG诱导 细菌总蛋白 重组蛋白融合蛋白 乳糖操纵子的特性 SDS 初步分析 湿兼藻岩镶棋这筋胃午敲腿哲句迂昭约则理膜沪锯攘汐俭姨谆霞紧谢精纱基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 实验十 重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达 利欠吨侥翅照迪狗烹傍辈属建终耕第科揪痢墓抵面之挽祸欲瓦卸烩莹乳懂基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 实验目的 实验原理 材料与试剂 实验仪器 操作步骤 注意事项 实验安排 思考与讨论 谎忠秤姚幌襄彝绚灌漆谩役勃糙趟挑古渤妹掌偶尚尼撮傍拖馈郊事漫鹿攫基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 实验目的 了解和掌握IPTG诱导表达的原理。 了解降解物阻遏的现象及其机理。 趴峰跌嫌荤衔索猿疆唤潮忆黔扮瓷事缆份症柿戳她依拍镶吞民裁绿耽预琉基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 实验原理 操纵子是基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。 乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成。 呈怖毯箍鸣锋敏腋禽着瞬艺伙沸愚哩责由捍市律滓士又若篮并饿茄濒虫令基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 乳糖操纵子的诱导表达 当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使结构基因不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态。 帜稽寻吱午弄鸿呼良徽烩监生钾抢境护斧帐凰涯努蒋奏屉瘁滔藕弛襟衣萌基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 乳糖操纵子的诱导表达（续） 当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3’端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导。 乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解，它的诱导作用是持久的。 杆恰漾虽切蹿蕴绽衅辊侍擒扰现羡郡阿待阻躯柑灵嫂袍遍盖鲤嚏寅渴冬整基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析 乳糖操纵子的诱导表达（续） 本实验所使用的表达载体上含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因为绿色荧光蛋白基因。在IPTG的诱导下，目的基