蛋白质的修饰和表达03ppt课件.pptVIP

1．利用基因融合技术表达外源基因的缘由 外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解 通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白，利于快速回收、纯化 融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白 通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在细胞内形成包涵体 基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功能的研究 2．1 基因融合的策略 将重组基因直接剪接于适当的信号肽之后 将外源基因本身按阅读框架自我融合。对一些小肽的稳定表达、表达产物的活性非常重要 目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的C端或N端融合 分泌－亲和融合。即：信号肽－融合蛋白－目标基因 双亲和融合法。即将目标基因与两个不同配基有特异亲和的异源或载体蛋白融合 分泌－插入融合法。此法是将目标基因插入到信号肽序列和一插入序列之间，此插入序列是一种插入到细胞膜或细胞壁的蛋白编码 设计目的：用以将受体或抗原定位于细胞的外表面或装配成融合蛋白进入类病毒颗粒，利于开发疫苗，或产生具有免疫原的复合物 2．1 基因融合的策略 2.2 产生蛋白质分子嵌合体的策略 通过限制性内切酶位点连接 条件：两个蛋白质之间有相同的限制性内切酶位点 通过缺失突变的方法连接 条件：两个蛋白质之间有相同的额外的碱基序列 通过PCR双侧重叠延伸法 该法可以在不需要分子间具有相容的限制性内切酶位点，将两个编码不同蛋白质的DNA分子重组，形成DNA分子嵌合体 3．蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接 1990年Saccharomydes cerevisiae发现在腺苷三磷酸核苷酸酶中蛋白质会发生自我剪接（protein splicing），从而首次发现第一个蛋白质内含子——Sce VMA 蛋白质内含子(intein)是蛋白质中的一段多肽链, 它靠自我剪切的方式从前体蛋白中分离出来, 而两端的外显子以肽键的方式相连 基因融合的用途 上述这些基因融合策略，主要是有利于： 外源基因的表达 表达产物的分离 纯化以及细胞定位 作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。 第三节 重组蛋白质的表达 重组蛋白质在大肠杆菌中的表达 重组蛋白质在酵母细胞中的表达 重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达 一、大肠杆菌中表达体系的优点 大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。 利用大肠杆菌作为表达体系的优点： 1）遗传学和生理学背景清楚； 2）容易培养，特别是高密度发酵； 3）外源基因经常可以达到高效表达。 大肠杆菌表达体系的缺点 大肠杆菌系统最大的不足之处是： （1）不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等； （2）广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制。 （3）外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体； （4）而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的N末端。 最后，由于真核mRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，（5）有时不能得到足够的产物。 大肠杆菌表达体系的应用 当外源蛋白质的分子量小于70kD,不存在半胱氨酸或分子内的二硫键少于3～4个，以及不需要翻译后修饰而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大肠杆菌系统得到满意的结果。 1．表达载体的一般特点 (1) 复制起始点 (2) 选择性基因 (3) 强的、可诱导的启动子 (4) 强的转录终止序列 (5) 核糖体结合位点 (6) 合适的多克隆位点 (1) 复制起始点 绝大多数载体利用pBR322或pUC质粒来源的复制起始点（如，pET28系列） 复制起始点决定了细胞内质粒的拷贝数 pBR322或pUC质粒来源的质粒可保持20——50个拷贝数和150——200个拷贝数 (2) 选择性基因 载体上要含有至少一个选择性基因 作用： 1）保证对转化体的筛选 2）保证在培养过程中受体细胞质粒不丢失 种类： (3) 强的、可诱导的启动子 原核细胞的启动子包括了RNA聚合酶的识别位点和结合位点 启动子序列通常包含了－10区（TATAAT）和－35区（TTGACA） 常用的种类：LacUV5、trp、tac、trc以及T7启动子 RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶识别位点 (4) 强的转录终止序列 为使目标基因有效的转录，需要满足两个条件： 转录终止序列 抗转录终止序列