生物材料的冷冻保存方法.docVIP

材料的个体特性使用的冷冻液体（配方等）冷冻的程序效果来源文献洪山公鸡精液PSE(Beitsville PoultrySemen Extender，BPSE) J，谷氨酸钠0．867 g，果糖0．500 g，磷酸氢二钾1．270g，TES0．195g，柠檬酸钠0．064 g，醋酸钠0．430g溶于100mL双蒸水，高压灭菌后，4℃冰箱保存待用。颗粒型精液的冷冻方法从不同个体采集到的新鲜精液混合后用BPSE加甘油(Sigma公司产品)(甘油占最终体积的11％，v／V)以1：2稀释后置5℃冰箱平衡1h。之后，用吸管直接将精液滴入液氮当中，每一滴大约为0．1mL。细管型精液的冷冻方法用与冷冻颗粒型精液相同的程序将精液作1-2稀释(甘油浓度同上)，然后将一端用铁珠封口的细管(0.5mL)倒置插入盛经稀释后精液的烧杯，置5℃冰箱lh后取出，并将细管平铺在铜筛(直径20cm)上，吊人液氮罐。通过调节铜筛底距液氮面的距离，并用低温温度计的探头(MCT-11一T)监测温度下降的速度，将温度下降的速度控制在3～5。C／min之间，温度降到-35％时将细管浸入液氮。细管型冷冻精液解冻后的存活率显著高于颗粒型冷冻精液(P0．01)。细管型冷冻精液解冻后的顶体完整率为0．613±0．049，颗粒型冷冻精液解冻后的顶体完整率为0．4760．057(n=20)，两者差异显著(P0．05)。颗粒型冷冻精液的受精率显著高于细管型(p0．01)。洪山公鸡精液冷冻保存方法及效果的研究作者： 刘建忠， 朱艳君， 张一玲刊名：武汉科技大学学报（自然科学版）年，卷(期)： 2005,28(2)绵羊卵母细胞冷冻基础液、卵黄、糖类、sTM、sDs(十二烷基磺酸钠)配制成的冷冻液成熟卵母细胞(成熟培养22h)移入5％冷冻液平衡5min。再移人10％冷冻液平衡5min，然后每20枚左右卵母细胞迅速装入0．25 mL细管。放人冷冻仪进行冷冻，起始温度20℃，l℃／min的速度降温至一6．3℃植冰．平衡lOMin后，0．3℃／min的速度降温至一33℃，投入液氮保存。常规冷冻保存的卵母细胞进行体外受精后卵裂率为26．06％，远远低于正常体外受精的比例(67．7％)。绵羊卵母细胞冷冻保存方法的研究作者： 李辉， 张居农刊名：云南畜牧兽医年，卷(期)： 2002(4)莎能奶山羊皮肤成纤维细胞细胞悬液：胎牛血清：DMs()=7：2：1的比例配制成细胞冷冻保存悬液纯化后传代培养的成纤维细胞贴壁生氏达90％左右，倒去培养液，用生理盐水清洗，每个25mI，组织培养瓶加入300μL Trypsin—EDTA(0．25％Trypsin，lmmol／L EDTA、4Na)消化3～5min，在显微镜下观察细胞的收缩情况，DMEM／F12+20％胎牛清+100Iu／mL双抗完全培养液终止消化后，用移液枪将细胞轻轻吹打下来，1000r／min、离心5min．弃上清液后并收集细胞，重悬于DMEM双抗完全培养液，经过两次离心和收集细胞，得到的细胞按细胞悬液：胎牛血清：DMs()=7：2：1的比例配制成细胞冷冻保存悬液，加入到1．8mI冻存管(Corning)中，然后将冻存管分类冻存。先在4C预冷平衡0.5h液氮罐口气念氮悬挂4h，然后沉人液氮。活细胞率为84．8％，培养48h后细胞贴壁率为85．4%莎能奶山羊皮肤成纤维细胞几种冷冻保存方法的研究作者： 王亮， 刘婷婷， 彭涛， 帅志强， 张达江， 朱海， 陈军， 李卫华， 汪汉卿刊名：西北农业学报年，卷(期)： 2005,14(6)牙鲆(Paralichthys olivaceus )不同时期的胚胎采用以NaCl、KCI、CacCl·2H20、MgCI，·6H2O、NaHC03配制而成的基础液。与渗透性抗冻剂l，2一丙二醇(PG)、甲醇(MeOH)、甘油(Gly)、乙二醇(EG)、二_甲基甲酰胺(DMF)、二甲基业砜(DMSO)、酒精(EtOH)，非渗透性抗冻剂聚乙烯毗咯N(PVP)、蔗糖(Suct-ose)、葡萄稀(Glucose)、葡聚糖(Dex)、D果糖(D—fructose)配成不同浓度的抗冻液(液体试剂v／v，固体试剂m／V)按1．5筛选到的PM与DMsO混合比例(体积比3：1)配置总体积分数为35％的混合抗冻液，添加5％的非渗透性抗冻剂蔗糖配成玻璃化液。室温条件下平衡牙鲆尾芽期至心跳期胚胎：分步平衡足先在1／4浓度的玻璃化液中平衡90 min ，再于1／2浓度的玻璃化液Il-平衡10min，最后放入玻璃化液中立即开始冷冻，10min后停止冷冻，冷冻胚胎中包括最后一步平衡时间为lmin至20min的胚胎；一步平衡时，将胚胎直接加入玻璃化液平衡5 min，然后开始冷冻，直至胚胎在玻璃化液平衡20min时停止冷冻。不同时期牙鲆胚胎在玻璃化液中的存活率随着