[医学]07 生化技术tan.ppt

诺贝尔奖近百年的历史，在91项生理学或医学奖中有31项与生化与分子生物学有较密切的关系，而化学奖中则有34项相关；尤其是20世纪五十年代以来，52％的生理或医学奖和40％的化学奖属于生化与分子生物学领域，二者之和相当于另外设立了一个生化与分子生物学诺贝尔奖。 生物化学技术与分子生物学技术 生物化学技术分子的分离纯化鉴定定量 包括分光、层析、电泳、离心、超滤等 分子生物学技术基因、分子水平的系列操作， 把生化、微生物免疫等技术相结合形成系统， 包括PCR技术、基因克隆表达技术、分子杂 交印迹、单克隆抗体技术、RNAi技术、基因 敲除、基因诊断与基因治疗、芯片技术、 mRNA差异显示技术等 得到高质量的符合要求的研究材料是进行分子生物学研究面临的首要问题，也是关键性的第一步 对特定生物分子进行定性\定量分析是最常用的研究策略 一、常用生化分离纯化技术 １.层析技术 ２.电泳技术 ３. 分光技术 ４.离心技术 1、层析技术 基本原理 　　　层析系统都由互不相溶的两相溶剂（固定相和流动相）组成，利用样品各组分的物理化学性质的差异，使待分离的各组分以不同程度分布在两相中，以不同速度随流动相移动，最终达到分离目的。 　　　在一定温度下达到平衡后，某种溶质在两相中的浓度比是个常数，称分配系数（KD），它是物种的特征常数之一。 溶质在固定相中浓度 KD=—————————— 　溶质在流动相中浓度 系统组成 固定相（介质） 惰性支持物 流动相（展层剂） 常见层析技术类型 按 原 理 分　　　　 吸附层析 分配层析 吸附分配层析 离子交换层析 分子筛层析（凝胶层析） 亲和层析 共价层析 通常把原理、装置和固定相结合起来命名： 　　DEAE纤维素柱层析 活性碳吸附柱层析 琼脂糖凝胶层析 分辨率与分离效率 分辨率 以层析系统的溶剂体积相对溶质浓度作图，相邻两峰的分开程度称为分辨率。分辨率反映了分离的效果。 装置的形状尺寸（例如柱层析中柱的长度、直径），以及物质的分配系数均影响分辨率。分配系数差异越大，则分离峰相距愈远，分辨率越高；对柱层析而言，柱越长越细，分辨率越高。 分离效率 单位时间内分离溶质的量称分离效率，对柱层析来说称柱效率。分配系数差异越大，柱越短越粗，分辨率越高 柱层析 固定相不同原理不同 吸附层析：吸附力差异 活性炭、硅藻土、纤维素、氧化铝 分配层析：分配系数（溶解度）差异 滤纸 离子交换层析：极性差异 离子交换树脂、羧甲基纤维素CM、DEAE 分子筛层析（凝胶层析）：分子大小 葡聚糖Sephadex和琼脂糖凝胶 Sepharose 亲和层析：专一吸附力（配基或配体、受体） 薄层层析与纸层析 展层时分配系数不同的溶质在薄层板上移动速率不同而得到分离 用于小分子分离分析 原点到层析点中心的距离 迁移率Rf= 原点到溶剂前沿的距离 萃取与分配层析不同 甲乙物质在固定相A 、流动相B中 分配系数不同：2、0.5 高效液相层析 HPLC利用高压泵产生的高压力驱动流动相流过色谱柱 很高的柱效率（分辨率），有高压、高速、高灵敏度、易自动化等特点，灵敏度高达10—9g（紫外检测），甚至10—11g（荧光检测） 2、电泳技术 带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。电泳技术依据生物分子在溶液中带电性质及分子大小、形状有差别，从而在电场中的迁移率不同而将其分离纯化 分类 按支持介质的不同可分为 ⑴醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis） ⑵ 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） ⑶聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（PAGE） ⑷等电聚焦电泳 按支持介