胶原蛋白诱导性关节炎小鼠th1th2细胞及其细胞因子的动态研究-dynamic study on th1th2 cells and their cytokines in collagen-induced arthritis mice.docx

中 中 文 摘 要 PAGE PAGE 1胶原蛋白诱导性关节炎小鼠 Th1/Th2 细胞及其细胞因子的动态研究摘 要类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性全身炎症性疾 病，以外周关节持续性和进行性滑膜炎，继而引起不同程度软骨破坏和骨 侵蚀，造成关节畸形和强直为主要临床表现，属于自身免疫性疾病， 70%~80%患者最终可发展成不同程度的功能障碍，甚至残疾。目前我国 RA患者人数多达400多万，是目前造成我国人民丧失劳动力主要原因之 一。RA的病因及发病机制尚不明确，感染、环境、遗传和免疫等因素共 同发挥作用。近些年随着免疫学的进展发现：CD4+T细胞中的Th1/Th2亚 群参与RA免疫应答的各个阶段，在RA发病机制及疾病进程中起重要作 用，但报道的结果却不尽相同。目的:通过建立胶原蛋白诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）小 鼠模型观察 Thl 和 Th2 细胞亚群在 CIA 整个病程演变中的动态变化，深 入探讨 Th1/Th2 细胞及其分泌的细胞因子在 RA 致病机制中的意义，为 RA 的治疗提供一定的理论依据。方法：1 分两批购买 SPF 级雄性 DBA1/J 小鼠，每批 90 只，其中 42 只为正 常对照组，其余 48 只建立 CIA 模型。每批按随机数字表法随机分 7 个时 间点（初次免疫后第 7 天、14 天、21 天、28 天、35 天、42 天、56 天）， 每个时间点再按随机数字表法分正常对照组 6 只，CIA 模型组 6 只。2 每个时间点常规无菌摘眼球取血分离血清，Flowcytomix 法检测血 清中 Th1 型细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL -2）和 Th2 型细胞因子（IL-4、 IL-5、IL-6）水平。3 每个时间点常规无菌摘眼球取血后处死小鼠，解剖取出脾脏制备成 单细胞悬液，应用流式细胞术检测小鼠脾脏 Th1、Th2 细胞数量。4 每个时间点常规无菌摘眼球取血后处死小鼠，解剖取出脾脏制备成单细胞悬液，应用实时荧光定量 PCR 技术检测 Th1 细胞特异性基因 T-bet和 Th2 细胞特异性基因 GATA 的表达水平。5 采用 SPSS17.0 软件包进行统计分析。所有数据均以均数±标准差（?x±S）表示，两两比较用 t 检验。以 α=0.05 为显著性检验水准。 结果：1 流式细胞术检测 Th1、Th2 细胞与同期正常对照组比较，CIA 小鼠脾脏 Th1 细胞百分率在初次免疫后 第 7 天和第 14 天均明显增高（P＜0.01），第 21 天与正常组无显著性差异（P＞0.05），第 28 天 Th1 细胞百分率又显著升高（P＜0.01），第 35 天 Th1 细胞百分率降低到正常组水平（P＞0.05），第 42 天 Th1 细胞百分率 继续降低，与正常组比较有显著性差异（P＜0.01），第 56 天 Th1 细胞百 分率与正常组无显著性差异（P＞0.05）。与同期正常对照组比较，CIA 小鼠脾脏 Th2 细胞百分率在初次免疫后 第 7 天和第 14 天均高于正常组（P＜0.01），第 21 天和第 28 天与正常对 照组比较无明显差异（P＞0.05），第 35 天和第 42 天 Th2 细胞百分率有升 高趋势，均明显高于正常对照组水平（P＜0.01），而到第 56 天降低到正 常对照组水平（P＞0.05）。2 实时荧光定量 PCR 检测 Th1 细胞特异转录因子 T-bet 和 Th2 细胞特 异转录因子 GATA 的基因表达。与同期正常对照组比较，CIA 小鼠脾脏在初次免疫后第 7 天和第 14 天 T-bet 表达水平均明显增高（P＜0.05），而第 21 天 T-bet 表达水平下降 与正常组无显著性差异（P＞0.05），第 28 天 T-bet 表达水平又开始升 高（P＜0.05），初免第 35 天 T-bet 表达水平与正常组比较无显著性差 异（P＞0.05），第 42 天 T-bet 表达水平开始下降（P＜0.05），第 56 天 T-bet 表达水平与正常组无显著性差异（P＞0.05）。与同期正常对照组比较，CIA 小鼠脾脏在初次免疫后第 7 天 GATA 表 达水平与正常对照组无明显区别（P＞0.05），至第 14 天 GATA 表达开始 增高（P＜0.05），第 21 天和第 28 天 GATA 表达下降至正常水平（P＞0.05）， 而初次免疫第 35 天、第 42 天和 56 天 GATA 表达有上升趋势，与正常组 比较差异显著（P＜0.05）。3 Th1、Th2 细胞型因子的动态观察3.1 Th1 型因子的动态观察CIA 模型组小鼠血清 IFN-γ 水平在初次免疫后第 7 天与正常组比较无