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金银花活性成分绿原酸与不同蛋白质相互作用机制比较分析研究 　　[摘要] 目的：分析比较金银花活性成分绿原酸（chlorogenic acid，CGA）与乳铁蛋白（bovine lactoferrin，BLF）及血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的分子作用机制。方法：光谱法结合计算机模拟技术测定药物与蛋白质相互作用的结合参数、能量转移参数与热力学函数，探讨分子作用机制并比较分析绿原酸与不同蛋白质的相互作用差异。结果：CGA与BLF的相互作用表现为动态分子作用机制，而CGA与BSA结合生成静态复合物，结合强度因温度不同存在一定差异；金银花活性成分与各蛋白质的结合距离 r 均很小，说明发生了能量转移现象；分子模建结果显示药物与蛋白质的相互作用力主要是氢键，兼有范德华力和疏水作用。结论：计算机模拟与实验测试获得了一致性结果。 　　[关键词] 绿原酸；乳铁蛋白；血清白蛋白；荧光光谱；紫外吸收光谱；分子模建 　　[收稿日期] 2013-01-19 　　[基金项目] 国家自然科学基金项目；浙江省科技创新项目 （2112009007） 　　[通信作者] *郭明，Tel：（0571E-mail： guoming@zafu.edu.cn 金银花活性成分绿原酸（chlorogenic acid，CGA）是由咖啡酸（caffeic acid）与奎尼酸（quinic acid）生成的缩酚酸[1]。CGA具有抗菌、利胆、降压、抗肿瘤、抗氧化和抗衰老等功效[2]。绿原酸的药理活性已经应用于食品、医药和日用化工等多个领域。 　　血清蛋白质高丰度组分含有白蛋白、转铁蛋白（乳铁蛋白为转铁蛋白家族之一）、免疫球蛋白等。白蛋白、乳铁蛋白具有贮运内源代谢产物和外源药物分子/离子等重要生理功能[3-4]，是药物分子与蛋白质分子相互作用研究中的理想模型分子。开展不同种类蛋白质与药物分子相互作用机制的比较分析研究，对于更全面地了解药物的功效性能、蛋白质的结构与功能以及蛋白质与药物之间相互作用的本质都有重要意义。BLF与BSA结构迥异，BLF由689个氨基酸残基组成，呈“二枚银杏叶型”立体结构，包括C叶和N叶，中间通过“铰链区”联接。每叶又包括2个结构域（N-1和N-2，C-1和C-2）。在每个叶的2个结构域之间结合铁离子[5-7]。BSA[8]由582 个氨基酸残基组成，空间结构含3个结构域，每个结构域由2个亚结构域以槽口相对的方式形成圆筒结构，圆筒内部构成疏水腔。CGA作为一种活性中药成分与乳铁蛋白的相互作用研究未见报道，也仅有与亲和色谱HSA（人血清白蛋白）固定相的相互作用研究，故开展CGA与BLF，BSA相互作用机制的研究非常有必要。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器与试剂 绿原酸（CGA，≥99%，南京泽朗医药科技有限公司）；牛乳铁蛋白（bovine lactoferrin，BLF，≥98%），牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA， ≥98%），三羟甲基氨基甲烷（Tris， GR） 均购自上海华美生物工程公司；其他试剂均为分析纯，实验用水为亚沸蒸馏去离子水。配制0.1 mol·L-1，pH 7.3 Tris-HCl缓冲溶液（内含0.10 mol·L-1 NaCl维持离子强度），用此缓冲溶液配制1.0×10-5 mol·L-1BFL/BSA溶液及1.0×10-3 mol·L-1CGA溶液。F-4500型荧光光度计（日本Hitachi公司）；UV-2450型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；SGI O2计算机图形工作站。 　　1.2 方法 CGA-BLF/BSA荧光光谱及同步荧光光谱测定：移取2.5 mL BLF，BSA溶液于1 cm石英比色皿中，微量进样器逐次加入1.0×10-3 mol·L-1 CGA溶液进行荧光滴定（滴定剂累加体积≤200 μL），Tris-HCl缓冲溶液做荧光空白校正，狭缝宽度为2.5 nm，扫速200 nm·min-1，固定激发波长282 nm，绘制250～500 nm发射光谱；荧光光谱仪扫描激发和发射波长之间波长差分别为 Δλ =15 nm和 Δλ =60 nm上述溶液体系的同步荧光光谱。 　　CGA-BLF/BSA紫外吸收光谱测定：移取2.5 mL Tris-HCl缓冲溶液于1 cm石英比色皿中，逐次加入1.0×10-3 mol·L-1 CGA溶液，使其浓度为1.0×10-5 mol·L-1，测定200～500 nm紫外吸收谱。 　　1.3 计算机模拟 利用SGI O2工作站上的DOCK 4.02程序包建立药物与蛋白质相互作用模型，进行分子模拟计算。受体蛋白BLF的晶体结构从PDB蛋白质晶体数据库获得，编码3O97；受体蛋白