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超声波在山核桃果壳黄酮提取中应用 　　摘 要：山核桃果壳作为一种农业废弃物没有得到充分利用，其中含有包括黄酮在内的大量天然活性物质。该文通过一系列的单因素和正交试验，得出了使用超声波提取山核桃果壳中黄酮的最佳提取工艺。 　　关键词：山核桃果壳；黄酮；超声波；提取 　　中图分类号 S792 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）24-15-03 　　山核桃是一种落叶乔木，属胡桃科山核桃属，其果实形似核桃而小于核桃，故又称小核桃。我国是山核桃原产国之一，主要分布在浙江临安、淳安、安吉、桐庐和安徽宁国、歙县、绩溪等地方，其中以浙江临安最多[1]。随着对山核桃需求量的与日剧增，林农种植山核桃取仁后遗弃大量的果壳，形成大量的农业废弃物。常规的处理只是将果壳焚烧掩埋，会造成土地碱化等污染问题；或者将果壳制成活性炭，其中大量的天然活性成分没有得到充分利用。 　　据研究表明，山核桃果壳中的活性成分有多糖、皂苷、黄酮、强心苷、甾体及三萜、蒽醌、挥发油、生物碱等各类化学成分。黄酮类化合物[2]是一类存在于自然界具有2-苯基色原酮结构的化合物。它具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗炎镇痛、抗氧化衰老、免疫调节等。通过合适的方法提取山核桃果壳中的黄酮成分可以有效利用山核桃果壳的价值。目前常用的提取方法有浸提法、回流提取法、超声波萃取法等。考虑到成本等因素，常用的提取溶剂是乙醇，由于乙醇的沸点是78℃，回流提取所需的温度过高，会影响黄酮等天然物质的活性，同时能耗增大。超声波[3]具有振动空化、机械粉碎和搅拌等作用，可以提高黄酮类化合物在溶剂中的溶解性。同时，超声波提取具有快速、能耗低、提取率高等优点。本研究通过正交试验，探讨采用超声波提取山核桃果壳中黄酮的最佳提取工艺，以期为有效利用山核桃果壳提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 实验材料 山核桃果壳，购于浙江省临安市志成炒货食品厂。洗净山核桃果壳上的尘土杂物后，在60℃烘干至恒重，用粉碎机粉碎，过100目筛，储存于干燥皿中备用。 　　1.1.2 实验仪器 多功能电磁搅拌器、超声波清洗器（可调温度、时间）、752型紫外可见分光光光度计，离心机、电子天平、电子分析天平、循环水式真空泵、旋转蒸发仪、粉碎机。 　　1.1.3 实验试剂 芦丁标准品，购于中国药品生物制品检定所。95%乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠均为国药集团分析纯。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 实验的技术路线 山核桃果壳洗净→60℃烘干至恒重→粉碎机粉碎→过100目筛→将适量样品和乙醇溶液混合均匀，多功能电磁搅拌器搅拌均匀升至合适温度→在一定的温度下超声波萃取黄酮溶液→离心机离心，取上清液→旋转蒸发仪浓缩至合适体积→测定其中的黄酮含量。 　　1.2.2 提取方法的确定 黄酮提取的效果主要受到浸提液浓度、料液比、超声波作用时间、提取温度等因素的影响。本实验采用单因素和正交试验结合的方法确定最适合的提取工艺。 　　1.2.3 黄酮含量的测定[4] 采用硝酸铝比色法。常用的检测方法有分光光度计法和液相色谱法，考虑到实验室现有条件，采用分光光度计法。黄酮与铝离子在碱性与亚硝酸存在条件下形成黄酮的铝络生物，呈现稳定的黄色。根据Lamber-beer定律，在一定的范围内，生成的黄色物质与黄酮含量呈一定的比例关系，可以采用芦丁标准样品作标准，于510nm波长处进行比色定量测定。 　　2 结果与分析 　　2.1 山核桃果壳黄酮提取方法的优化 　　2.1.1 黄酮提取的实验原理 采用相似相溶的原理，在超声波的作用下，通过乙醇将在其中溶解度较大的黄酮类物质提取出来。 　　2.1.2 标准曲线的制备[5] 准确称取经105℃恒温干燥至恒重的芦丁标准样品84mg。用50%乙醇溶解，用250mL容量瓶定容，制成标准溶液。用洗液管分别吸取上述标准溶液2mL、4mL、8mL、12mL、16mL于50mL的容量瓶中，用50%乙醇溶液补充至20mL，加入1.4mL亚硝酸钠（5%）溶液，摇匀放置4min，接着加入1.4mL硝酸铝（10%）溶液，8min后再加入5mL氢氧化钠（1mol/L）溶液，摇匀。用50%乙醇定容。分光光度计开机预热20min后于510nm处测定吸光度，试剂为空白参比。以芦丁标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。 　　 　　图1 芦丁标准曲线 　　2.1.3 提取液中黄酮含量的测定 用微量取液器吸取提取液2.5mL于50mL容量瓶中，采用上述的测定方法测定提取液的吸光度，测定时需与标准曲线的制备同时进行，以确保条件一致，计算提取率Y。进行3次重复试验。Y=（CxV）/M，其中，C─黄酮的质量浓度，mg/mL；V─浓缩后的体积，mL；M─提取用山核桃果壳粉末的质量，mg；x─稀释倍数 　　2.2 单