鸡血细胞融合.docVIP

《 PEG介导/鸡血细胞融合 》实验报告姓名翟贞文院系生物2012级学号201117140189小组成员于诚慧，王瑞璞指导教师评阅教师实验目的：了解并掌握细胞融合的基本原理和操作。了解细胞融合的应用范围尝试用细胞融合的观点解决生物问题练习光学显微镜的使用实验背景：通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cellfusion）或细胞杂交（cellhybridization）。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。诱导细胞融合的方法有三种： HYPERLINK /doc/5386765.html \t /doc/_blank 生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电激和激光）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusionprotein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。另一方面促进相邻细胞的磷脂双分子层融合。在表面张力作用下，发生细胞融合。再在细胞膜的修复功能与张力作用下，整合成一个多核细胞。实验材料：配置好的鸡的红细胞悬液（Alsever溶液与鸡血细胞混合液，4：1）；PEG（分子量约为4000）；GKN溶液；生理盐水；光学显微镜；普通离心机；量筒；滴管等实验步骤：（1）混合好的鸡血悬浮液取1毫升，加3毫升生理盐水混匀 （2）离心机离心 12000r/min离心2min，而后弃去上清液，加4ml生理盐水，混匀后，离心2min,12000r/min （3）取血细胞沉淀(0.2ml),，加适量GKN溶液稀释为10%血细胞溶液. （4 配制不同浓度的PEG与血细胞混合液A 取细胞悬液1ml,加0.5PEGmlB.取细胞悬液0.5ml，加0.5PEGmlC.取细胞悬液0.5ml，加1.0PEGml作用30s后，混匀，2min后制作临时装片，在显微镜下观察细胞融合情况。实验结果与分析：图 SEQ 图 \* ARABIC 1图 SEQ 图 \* ARABIC 2图 SEQ 图 \* ARABIC 3融合过程图（原图经剪切与对比度，亮度调整）示：图 SEQ 图 \* ARABIC 4 图 SEQ 图 \* ARABIC 5 图 SEQ 图 \* ARABIC 6在实验中，在PEG作用下，两相邻细胞膜相接触，在PEG作用下，细胞膜融合，在表面张力作用下，两细胞细胞质相连通，融合为一个多核细胞。一般来说，PEG分子量越大，融合效果越好。但过高的分子量也可能会使得细胞膜发生不可修复的破损，细胞破裂死亡。分子量常控制在400-6000，本实验不要求细胞融合后存活率高，故而分子量可略大。温度与膜的流动性呈正相关，且鸡血红细胞必须在恰当温度下才能较长时间保持活性，故而反应温度控制在38-40摄氏度为佳。作用时间通常来说越长融合率越高，但时间太长破损细胞发生凝集可能性越高，本实验将作用时间控制在2min左右。溶液的酸碱度控制在8.0-8.2为佳，可选择使用缓冲液GKN来调节。动物细胞膜常带有负电荷，鸡血细胞溶液在略偏碱性的溶液中活性较好。通常来讲，细胞之间相似度越高或亲缘关系越近，细胞融合越容易，反之，亲缘关系越远，融合率越低。即融合后多核细胞体系越稳定融合率越高。PEG介导鸡的血红细胞融合，相较危险性较高的病毒介导融合与电融合而言，具有操作简单，廉价，无毒，融合率较高的优点。但是，融合的精准性较差，即形成三核或更多核的可能性较高，相较电融合法而言，PEG介导融合强度受融合细胞之间亲缘关系影响更大。细胞融合的相关应用克服了远源物种不能通过有性生殖产生可育杂交后代的困难，实现了远源异种细胞杂交产生新的突变体的可能。可以用来育种。单克隆抗体的制备 1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后至敏的能产生抗体的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系。既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特