地榆总皂苷对巨核祖细胞增殖分化及相关受体表达影响.docVIP

地榆总皂苷对巨核祖细胞增殖分化及相关受体表达影响 　　[摘要] 目的：观察地榆总皂苷（DYS）对Baf3细胞和32D细胞的促增殖和分化作用，以及对IL-3受体和干细胞因子受体c-kit表达水平的影响。方法：培养依赖IL-3生长的Baf3细胞和32D细胞，在加或不加IL-3条件下，用质量浓度为5，10，20，30，40 mg?L-1的DYS分别处理细胞24，48，72，96 h后，采用CCK8方法检测细胞增殖；并用Giemsa染色检测细胞分化；另以RT-PCR方法检测DYS对Baf3细胞IL-3受体及对32D细胞c-kit表达水平的影响。结果：DYS单独处理细胞48 h，明显促进Baf3细胞和32D细胞增殖；与对照细胞比较，DYS处理32D细胞呈现成簇生长并形成许多大的细胞团；在加入IL-3的条件下，DYS也能明显增强IL-3的促细胞增殖作用。此外，DYS高浓度单独处理32D细胞可明显诱导多倍体巨核细胞数增加，促进巨核细胞分化。在mRNA水平，DYS单独处理细胞也能明显上调IL-3受体和c-kit的表达。结论：地榆总皂苷单独作用能促使2种巨核祖细胞的增殖和分化，其作用与上调IL-3受体和c-kit表达水平有关。 　　[关键词]地榆总皂苷；造血细胞增殖；巨核细胞分化；白细胞介素3；白细胞介素3受体；干细胞因子受体 　　地榆总皂苷（DYS）促造血作用已从体内外研究中获得证实[1]，作者前期的研究发现[2]，DYS可单独或协同细胞因子促进造血细胞增殖，尤其，DYS单独处理能显著增加依赖促血小板生成素（TPO）生长的Baf3/Mpl细胞增殖，且在mRNA水平促进TPO受体（TPOR）的表达。Baf3/Mpl细胞源自于小鼠髓系巨核祖细胞系Baf3，后者依赖IL-3生长。通过转入TPOR后，Baf3细胞也可依赖TPO生长，因此命名为Baf3/Mpl细胞。尽管已证实DYS单独能促进Baf3/Mpl细胞增殖，且与上调TPO受体表达水平有关，但Baf3/Mpl细胞也表达IL-3受体，DYS的促增殖作用与IL-3受体是否也有关联，尚值得进一步探索。本研究采用未经Mpl受体转染的Baf3亲本细胞在加入或缺乏IL-3的体外培养条件下，观察地榆总皂苷对细胞生长的影响，同时研究了地榆总皂苷对IL-3受体表达的影响；另选择了依赖IL-3生长的32D小鼠髓系祖细胞系，研究了地榆总皂苷的促增殖作用，并观察了DYS诱导巨核细胞分化的作用以及对干细胞因子受体c-kit表达的影响，为进一步探索促造血的多效性奠定基础。 　　1材料 　　1.1地榆总皂苷制备 取干燥地榆（购自成都市五块石药材市场，并由成都中医药大学贾敏如教授鉴定为地榆Sanguisorba officinalis L.）粉碎成粗粉，称取500 g并加入10倍量95%乙醇浸泡30 min，回流提取3次，每次60 min，尼龙布过滤；合并提取液，减压过滤得透明微红色液体，减压回收乙醇，加水混悬，保温至60 ℃，乙酸乙酯趁热萃取，连续3次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，即得地榆总皂苷粗提物。HPLC测定地榆皂苷I质量分数大于70%。使用前用DMSO溶解，无菌PBS稀释至1 g?L-1，待用。 　　1.2试剂与仪器 RPMI 1640培养基（Gibco）；新生胎牛血清（HyClone）；重组小鼠白介素3（mIL-3，Sigma公司）；一步法RT-PCR试剂盒（Takara）；二氧化碳培养箱（Sanyo公司）；普通光学显微镜和倒置相差显微镜（Olympus公司）；多功能酶标仪（Perkin Elmer公司）。 　　2方法 　　2.1细胞及细胞培养 依赖IL-3生长的Baf3细胞和32D细胞系均购买自ATCC。细胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，IL-3（2 μg?L-1）参照说明补充加入培养体系中。 　　2.2细胞增殖测定 Baf3和32D细胞维持培养在对数生长期，用无血清培养基洗涤3次，悬浮于含0.5%胎牛血清的无细胞因子培养基中，次日以适量细胞数分别接种于96孔培养板内，分别设置空白对照组、地榆总皂苷单独处理组、IL-3单独处理组、地榆总皂苷+IL-3处理组。用无IL-3、无血清培养基稀释地榆总皂苷溶液，按照设置浓度加入细胞，使其终质量浓度分别为5，10，20，30，40 mg?L-1，IL-3浓度参照细胞维持生长所需浓度加入。细胞在37 ℃条件下连续培养至指定时间，采用CCK8试剂盒并参照说明书提供的方法进行细胞增殖检测。 　　2.3Giemsa染色和巨核细胞计数 Baf3和32D细胞分别接种于6孔板中，采用较高质量浓度（40 mg?L-1）的DYS分别处理2种细胞，Baf3细胞在DYS处理120 h后涂片用甲醇固定5 min，Giemsa染色10 min，染色后的标本用缓冲液洗涤，