基于GC―MS代谢组学法研究黄连、生地黄治疗Ⅱ型糖尿病配伍机制.docVIP

基于GC―MS代谢组学法研究黄连、生地黄治疗Ⅱ型糖尿病配伍机制 　　摘要： 该研究采用代谢组学方法对黄连、生地黄配伍前后用于Ⅱ型糖尿病治疗的配伍机制进行初步阐明。建立脂肪乳伴腹腔注射链脲佐菌素致大鼠Ⅱ型糖尿病动物模型， 比较黄连、生地黄及其不同比例配伍药对的降血糖、降血脂作用。基于气相色谱-质谱联用技术分析黄连、生地黄配伍前后大鼠尿样代谢轨迹，采用主成分分析法（PCA）研究各组间的代谢物组差异。生化指标结果表明，黄连、生地黄配伍前后均能降低高血糖、高甘油三酯、高胆固醇。尿样代谢组的PCA分析结果表明，黄连组最接近于正常组，不同配伍比例黄连、生地黄组没有明显区分。确定12个差异代谢物与Ⅱ型糖尿病相关，与模型组相比较，黄连给药后对其中7个差异代谢物有显著的回调作用。黄连、生地黄及其不同配伍比例药对在治疗Ⅱ型糖尿病时，黄连起到主要作用，是君药。生地黄是臣药，辅助黄连药材发挥药效作用，本研究为阐明中药配伍机制奠定基础。 　　关键词： 代谢组学；黄连；生地黄；Ⅱ型糖尿病；配伍机制 　　[收稿日期] 2013-11-12 　　[基金项目] 国家科技部中国国际科学与技术合作项目（2009DFA21450）；国家自然科学基金项目 　　[通信作者] *王静，副教授，研究方向为基于代谢组学对中药质量控制和评价的研究，Tel：（0411E-mail：wjyuanmeng@163.com 　　黄连、生地黄是临床常用药对，当二者配伍比例是1∶1时，名曰黄连丸，出自于孙思邈《备急千金要方》，主治消渴，具有良好降糖疗效，同时本课题组的前期实验结果亦表明，黄连确实具有治疗糖尿病的药效作用[1]。在临床上用于治疗糖尿病的中药复方中亦很多含有二者，疗效已被广大中医学者所认可，但对黄连与生地黄的配伍比例至今却无统一认识，大多凭各自经验而定，陈可冀院士最早提出宜采用大剂量生地黄配伍黄连[2]，其他学者也有类似报道[3]。由此可见，黄连、生地黄不同配伍比例时治疗糖尿病的药效作用差异及其配伍机制均有待于深入研究。因此本实验采用前沿的代谢组学[4]方法，以黄连、生地黄为研究对象，对二者配伍前后及不同配伍比例时治疗Ⅱ型糖尿病的药效作用差异进行研究，从而探讨黄连、生地用于降糖的配伍机制。 　　1 材料 　　1.1 动物 SPF级Wistar雄性大鼠，体重（160～180） g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号为SCXK（辽） 2010-0001。 　　1.2 仪器与试药 日本岛津气相色谱-质谱-QP2010仪（GC-MS-QP2010），配备EI离子源，AOC-20i自动进样器，CENCO型涡旋仪（荷兰Breda公司），Biofuge Stratos型低温高速离心机（德国Heracus公司），LABCONCO型冷冻干燥机（美国LABCONCO公司）；N，O-双三甲硅基三氟乙酰胺（BSFTA）、三甲基氯硅烷（TMCS）、脲酶和吡啶（分析纯，Sigma-Aldrich公司），链脲佐菌素（STZ）购自北京博爱港商贸有限公司。其余对照品均购自美国Sigma-Aldrich公司。黄连（四川，批号h、生地黄（河南，批号d饮片均购自大连阳光大药房，经辽宁中医药大学鉴定教研室李峰教授鉴定。 　　1.3 提取液及脂肪乳的制备 黄连提取液的制备：取黄连饮片适量，加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2 h，滤过，药渣再加8倍量水，煎煮2 h，滤过，合并滤液，减压浓缩至含生药1 g?mL-1的水煎液。置于4 ℃ 冰箱中备用。同法分别制成含生药1 g?mL-1的“生地黄提取液”、“黄连-生地黄（1∶1）提取液”、“黄连-生地黄（1∶8）提取液”。 　　脂肪乳的制备：取猪油20 g、甲基硫氧嘧啶0.5 g、胆固醇5 g、谷氨酸钠1 g、蔗糖5 g、果糖5 g、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80）20 mL和甘油10 mL高速搅拌混匀制成初乳，加水至100 mL摇匀即得）。 　　2 方法 　　2.1 大鼠Ⅱ型糖尿病造模方法及分组 每日给予大鼠标准食物和饮用水各2次，保持光照12 h和避光12 h循环饲养；实验开始前于室内饲养1 周。1周后，大鼠每日灌胃脂肪乳10 mL?kg-1，连续灌胃20 d。灌胃脂肪乳20 d后，大鼠禁食12 h，腹腔注射STZ 40 mg?kg-1，注射72 h后，用Ultra稳豪型血糖仪（美国强生公司）测大鼠的空腹血糖（FBG），血糖值大于11.0 mmol?L-1，为糖尿病大鼠，纳入实验。将糖尿病大鼠随机分为模型组、黄连组、生地黄组、黄连-生地黄（1∶1）组、黄连-生地黄（1∶8）组。大鼠每日上午给药（模型组给予等量生理盐水），下午灌胃脂肪乳10 mL?kg-1，正常组每日上下