硫酸锌诱导金属硫蛋白减轻再灌注肺细胞凋亡实验研究.docVIP

硫酸锌诱导金属硫蛋白减轻再灌注肺细胞凋亡实验研究 　　[摘要] 目的 探究硫酸锌诱导金属硫蛋白对再灌注肺细胞凋亡的影响。 方法 选取健康的雄性SD大鼠30只随机分为对照组、标准组和实验组，观察三组不同处理后的基本情况。 结果 标准组中的超氧化物歧化酶活性（95.7±25.7） U/mL，明显低于对照组（152.4±24.5） U/mL和实验组（138.5±15.8） U/mL，标准组的丙二醛含量（8.8±1.7） nmol/mL、髓过氧化物酶的活性（25.6±1.7） NU/mL明显高于对照组和实验组。标准组的金属硫蛋白含量（0.089±0.023） ng/mg明显低于对照组的（0.154±0.042）ng/mg和实验组的（0.263±0.06） ng/mg。标准组的肺细胞凋亡指数明显高于对照组和实验组。 结论 硫酸锌诱导金属硫蛋白通过减轻脂质过氧化反应和中性粒细胞聚集，从而改善肺组织超微结构的异常情况，并有效减轻再灌注肺细胞的凋亡。 　　[关键词] 硫酸锌；金属硫蛋白；再灌注；细胞凋亡 　　[中图分类号] R363 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）12-0003-03 　　临床中再灌注损伤的原因比较多，而且其具体的作用机制尚未明确。随着临床中不断的研究，发现金属硫蛋白是一种普遍存在于各种生物体中的多功能诱导蛋白，而且在不同病理的作用下，金属硫蛋白的含量也会发生明显的变化。临床中大量的研究表明，金属硫蛋白对再灌注损伤具有一定的保护作用[1]。因此，为了进一步了解金属硫蛋白与再灌注肺细胞凋亡之间的联系，本文对硫酸锌诱导金属硫蛋白对再灌注肺细胞凋亡的影响进行深入探究，现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物与分组 　　选取健康雄性SD大鼠，共计30只，均由温州医学院实验动物中心所提供，体重为210～270 g，平均（235.5±5.8） g，且均为清洁级。并采取随机数字表法分为对照组、标准组和实验组，每组均为10只，且三组大鼠的年龄和体重以及饲养方法等比较无明显的差异（P 0.05）。 　　1.2 仪器与试剂 　　仪器：RM2135型切片机、H-7500型透射电镜。试剂：丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）和超氧化物歧化酶（SOD）均由南京建成公司提供，In Situ Cell Death Detection Kit由瑞士Roche公司提供，BCA蛋白浓度测定试剂盒和大鼠MT ELISA试剂盒均由上海西唐生物科技有限公司提供。 　　1.3 模型制备 　　首先，将选取的大鼠进行腹腔注射5.0%的水合氯醛进行麻醉，并将其固定在鼠台上。然后在颈部正中进行切开，并进行有效的分离气管和右侧颈动脉，紧接着给予气管切开和插管处理，并给予动物呼吸机进行通气。其次，沿着大鼠的左胸骨进行切断第3和第4以及第5肋骨，并打开取胸腔，并游离于左肺门，进行穿过阻断带处理。对照组10只大鼠在左肺门游离后，进行留置阻断带，并进行观察150 min；而标准组在阻断左肺门后，进行观察30 min，并再次开放再灌注120 min；而实验组的10只大鼠在术前24 h给予注射3.6% ZnSO4（1.5 mL/kg），然后在阻断左肺门之后，进行观察30 min，并再次开放再灌注120 min。 　　1.4 金属硫蛋白测定 　　在进行模型制备实验之后，选取大鼠左肺组织并制成10.0%的组织浆，然后采取BCA法测定组织中的总蛋白含量，并采取双抗体夹心ABC-ELISA法测定组织浆中的金属硫蛋白含量，肺组织中金属硫蛋白浓度为组织浆中的金属硫蛋白含量占总蛋白含量的比[2]。 　　1.5 血清指标测定 　　在进行模型制备实验之后，抽取大鼠颈动脉血液2 mL，并进行离心处理，3 000 r/min，离心10 min。然后依据试剂盒的说明书进行规范性操作，并测定血清中的丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）和超氧化物歧化酶（SOD）含量[3]。 　　1.6 肺组织细胞凋亡测定 　　肺组织细胞凋亡的测定主要采取原位缺口末端标记法进行测定[4]，将每组大鼠进行肺组织石蜡切片处理，并选取1张，然后进行脱蜡-水化处理。然后，①给予蛋白酶K进行处理20 min，温度为37℃；②加入TUNEL restion mixture 50 μL/片，并温度控制为37℃，反应时间为1 h；③加入Conver-POD，温度为37℃，反应时间为30 min；④采取二氨基联苯胺（DAB）进行显色处理；⑤进行苏木素复染处理；⑥高倍镜下选取5个不同的高倍视野（×400）观察。凋亡指数=凋亡细胞数/观察细胞总数×100%。 　　1.7 电镜观察方法 　　选取大鼠左肺门旁的组织，大小为1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm。并给予2.5%戊二醛进行前固定，给予1.0%