鼠胚胎干细胞定向诱导为角膜上皮细胞实验研究.docVIP

鼠胚胎干细胞定向诱导为角膜上皮细胞实验研究 　　[摘要] 目的 建立能够稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的鼠胚胎干细胞系，并研究体外诱导鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，Es细胞）向角膜上皮细胞分化的可能性及条件，为角膜损伤提供新型的上皮修复组织来源。 方法 质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染鼠胚胎干细胞，对稳定表达GFP的ES细胞以Ⅳ型胶原作为诱导条件，定向诱导鼠ES细胞向角膜上皮细胞转化，观察培养后形态改变，免疫荧光及RT-PCR检测K12、K14及CD44的表达。 结果 转染后ES细胞稳定表达GFP，成功诱导出角膜上皮样细胞，呈典型上皮样细胞形态，免疫组化及RT-PCR检测显示，K12及CD44表达阳性，K14表达阴性。 结论 转染GFP的ES细胞，在Ⅳ型胶原的诱导下，成功向角膜上皮细胞分化。 　　[关键词] 胚胎干细胞；绿色荧光蛋白；分化；角膜上皮细胞；诱导 　　[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）03（b）-0013-03 　　角膜上皮位于眼角膜表面，是维持眼表正常生理功能的重要条件。健全的角膜上皮细胞是角膜抵御外界各种有害因素损伤的重要条件。人的角膜自我更新由位于角膜缘外围区域的角膜缘干细胞来维持，结构与功能健全的角膜缘干细胞是角膜上皮再生的主要来源，当角膜受到化学及热烧伤，以及患有Stevens-Johnson syndrome等疾病时，角膜缘上皮细胞将会缺失，导致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危险[1]。因此，重建完整的角膜上皮就显得异常重要。 　　胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）是从早期胚胎内细胞团分离获得的，具有体外增殖和全能性两大特点。近年来随着ES细胞研究的不断深入，其逐渐应用于细胞、组织的修复和移植[2]。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一种新型的报告基因，用GFP作为标志物来标记ES细胞，可用来追踪ES细胞在体内的分化[3]。本研究利用质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染鼠ES细胞，并在体外诱导鼠ES细胞向角膜上皮细胞分化，为治疗角膜损伤及重建角膜上皮提供细胞组织来源。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　鼠ES细胞由北京大学深圳研究生院分子生物学实验室提供。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、B-巯基乙醇、非必需氨基酸，购自Sigma公司；丝裂霉素C，购自Kogyo公司；脂质体Lipofectamine 2000、G418，均购自Invitrogen公司；白血病抑制因子（1eukemia inhibitory factor，LIF）、L-谷氨酰胺，购自Sigma公司；质粒pEGFP-N1，购自Clontech公司；明胶、TaqDNA 聚合酶，购自博大泰克公司；CK14、CK12、CD44引物，委托宝生物工程公司合成；免疫组化二抗试剂盒、DAB显色试剂盒，购自武汉博士德公司；其余为国产分析纯试剂。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 ES细胞的培养 ES细胞复苏后，经丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）做饲养层培养，加入预先铺有明胶（Ⅳ型胶原）的培养皿中，37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养，每日更换ES细胞培养液为高糖DMEM（内含0.1 mol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L谷氨酰胺、150 mL/L胎牛血清、1 000 U/mL LIF、15 g/L非必需氨基酸）。2～3 d传代1次。 　　1.2.2 转染及诱导ES细胞 将真核细胞表达载体pEGFP-N1转染ES细胞作为实验组，空载质粒转染ES细胞作为对照组。在转染前2 h改为无血清的DMEM培养液；含载体pEGFP-N1质粒的无血清DMEM 培养液与含脂质体Lipofectamine 2000的无血清DMEM培养液混合，加入ES细胞培养皿中，置37℃的CO2培养箱中培养，换液，培养基为不含LIF的ES细胞培养基。G418筛选GFP阳性细胞克隆，接种在丝裂霉素C处理的MEF饲养层上，继续扩增培养，获得稳定的转染细胞系。ES细胞诱导前去除饲养层细胞，接种于涂抹明胶（Ⅳ型胶原）的培养皿中，加入无LIF的ES细胞培养液，隔日换液，传3～4代，诱导ES细胞分化成角膜上皮细胞。 　　1.2.3 形态学和免疫组织化学鉴定 显微镜下观察ES细胞形态，诱导培养7 d后，细胞基本融合，将培养分化的ES细胞用PBS洗涤3次后，冷4%多聚甲醛固定30 min，正常山羊血清封闭30 min，滴加K14、K12及CD44单抗，4℃过夜，0.02% Triton-PBS洗涤，加人生物素标记的二抗，室温下孵育40 min，PBS洗涤数次后