骨髓干细胞分化成骨样细胞与可降解镁合金体外相容性研究.docVIP

骨髓干细胞分化成骨样细胞与可降解镁合金体外相容性研究 　　【摘要】 目的 探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨样细胞在可降解镁合金支架材料表面的生长情况，为研究镁合金与成骨样细胞的体外相容性提供实验数据。 方法 原代培养大鼠骨髓干细胞，并诱导其分化为成骨样细胞，行碱性磷酸酶（ALP）染色鉴定；将成骨样细胞支架材料复合培养，扫描电镜观察细胞形态；观察材料浸提液培养下细胞的形态，及增殖情况，ALP活度检测细胞的成骨分化情况。结果骨髓干细胞呈长梭形，可分化为成骨样细胞，碱性磷酸酶染色阳性。成骨样细胞与镁合金材料复合培养后，扫描电镜显示细胞生长旺盛，镁合金材料浸提液可促进大鼠成骨样细胞生长、增殖和分化。结论 可降解植骨材料镁合金与骨髓干细胞来源的成骨样细胞具有良好的组织相容性，有利于细胞黏附、生长增殖和成骨分化。 　　【关键词】 成骨样细胞；镁合金；相容性 　　随着生活节奏的加快，各种原因导致的骨组织损伤、缺损患者越来越多。目前临床治疗骨损伤的骨板、骨钉及植骨材料主要是不锈钢、钛合金及聚乳酸等。但这些材料不能降解需要二次手术取出，并且组织相容性差[1]。因此寻找力学性能好、组织相容性强，又可安全降解的新型骨组织工程支架材料意义重大。 　　最新发现表明镁合金具有良好的力学特性及人工可降解性，有望成为新型植骨材料，应用于骨损伤的固定及组织工程骨的支架材料[2]。但镁合金与细胞的生物相容性尚待探讨，其能否利于成骨细胞的生长增殖分化尚无定论。因此，本研究拟将骨髓干细胞诱导分化为成骨样细胞，并在体外与镁合金材料复合培养，检测成骨样细胞的形态、增殖能力及成骨分化情况，为镁合金的体外细胞相容性提供实验数据，为其能成为新型骨修复材料提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物 健康清洁级SD大鼠20只，体质量100～150 g，雌雄不限，由辽宁医学院实验动物中心提供。 　　1.2 主要试剂 L-DMEM、H-DMEM、胎牛血清（Gibco），胰蛋白酶、β-甘油磷酸钠（Sigma），碱性磷酸酶染色试剂盒、ALP活度检测试剂盒（凯基生物）。 　　1.3 大鼠BMSCs 的原代培养及向成骨样细胞分化 　　大鼠行颈椎离断法处死，无菌分离双侧股骨，含10%FBS的L-DMEM冲洗骨髓腔，接种至50 ml培养瓶中。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。每3 d换液，达80%融合时传代培养。 　　取P3的BMSCs，以0.5×105/孔的细胞悬液接种于铺有盖玻片的六孔板。待细胞达90%融合时更换成骨诱导培养液（含10%FBS的H-DMEM、10 mmol/L的β-甘油磷酸钠、10-7 mol/L地塞米松、5 mg/L抗坏血酸）。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，每3 d换液。 　　1.4 碱性磷酸酶（ALP）染色鉴定诱导后的成骨样细胞 　　当诱导后细胞达90%融合时，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗。碱性磷酸酶染色（按试剂盒说明进行），封片，光学显微镜观察。 　　1.5 可降解镁合金材料样品的制备 　　将镁合金（重量百分比：Zn 1.2%，Mn 0.6%，Ca 2.0%）支架材料用PBS清洗并吹干，置于24孔培养板，紫外线照射消毒正反面各2 h，备用。 　　1.6 成骨样细胞与镁合金材料的复合培养 　　消化制备2×105/ml的成骨样细胞悬液，接种到置于24孔培养板中的镁合金支架材料表面，孵箱内复合培养。24 h、48 h、72 h后行戊二醛固定，洗涤，脱水，CO2临界点干燥、喷金后，扫描电子显微镜细胞形态。 　　1.7 制备镁合金支架材料浸提液 　　无菌条件下，按照材料表面积/浸提介质为0.003 cm2/L的比例，加入成骨诱导培养液至盛有镁合金支架材料的容器中。孵箱中孵育24 h后提取容器中的液体，即为浸提液，应用此浸提液进一步培养成骨样细胞。 　　1.8 MTT法检测浸提液培养的成骨样细胞增殖活性 　　消化制备1×104/ml的成骨样细胞悬液，接种至96孔板，培养24 h后，将培养液换为浸提液，对照组加入普通的成骨诱导培养液，分别培养12 h、24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），37℃孵育4 h，每孔加DMSO 150 μl，震荡，用酶联免疫仪选择570nm波长测定各孔的光吸收值。 　　1.9 检测浸提液培养的成骨样细胞ALP活度 　　消化制备1×105/ml的成骨样细胞悬液，接种至6孔板，培养24 h后，将培养液换为浸提液，对照组加入普通的成骨诱导培养液，分别培养12 h、24 h、48 h、72 h后，胰酶消化制成单细胞悬液，超声粉碎细胞，按ALP活度检测试剂盒说明书进行碱性磷酸酶活度的检测。 　　1.10 统计学分析 　　所有数据均用均数±标准差表示，用SPSS 13.0软件，采用One