前列腺癌相关风位点rs1800477在LNCaP细胞系功能研究.docVIP

前列腺癌相关风险位点rs1800477在LNCaP细胞系功能研究 　　【摘要】目的：验证前期研究发现的前列腺癌相关风险位点rs1800477的功能。方法：选用前列腺癌LNCaP细胞系作为实验细胞，针对位点rs1800477构建慢病毒载体，并转染LNCap细胞，通过对LNCap进行划痕实验，比较各组的迁移率，实验分为4组；空白对照组（CON）： 正常LNCap细胞未感染任何病毒的细胞组；阴性对照组（NC）：正常LNCap细胞加阴性对照病毒感染的细胞组；野生型组（OE-wt）：正常LNCap细胞加目的基因BCL2野生型病毒感染的细胞组；突变型组（OE-mu）：正常LNCap细胞加目的基因BEL2突变型病毒感染的细胞组。分别于6h和24h测量各组的细胞迁移距离并计算迁移率。结果：6h和24h时，野生型组和突变型组均出现差异，野生型组细胞迁移率分别为（0.24±0.02）%和（0.40±0.03）%，突变组细胞迁移率分别为（0.23±0.01）%和（0.41±0.03）%，与空白对照组比较差异均有统计学意义（p均中国论文网 /6/viewhtm 　　【关键词】前列腺癌；LNCap；风险位点；功能研究 　　【中图分类号】R737.25 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）03-0092-01 　　*基金项目：国家自然科学基金资助项目（NoNo. 　　广西医科大学研究生创新课题（No. YCSZ2014106） 　　前列腺癌在男性致死性疾病中排名第六，近20年前列腺癌全球内的发病率逐年增加[1]。2008年的一项对年龄小于75岁的男性前列腺癌调查研究报道显示，有903500名男性被确诊为前列腺癌，其中258400人因前列腺癌导致死亡。前列腺癌不仅能在因原位器官引起症状，转移到其他器官引起的病症能带来更大的痛苦，这不仅增加了家庭的负担还给全社会造成了很大影响。越来越多的科学家试图从基因水平揭露前列腺癌的发病机制。遗传多态性是最常见的遗传变异，但遗传因素导致的癌症的确切机制还没有研究清楚。单核苷酸多态性（SNPs）的研究表明位点突变通过与环境因素的相互作用引起相关癌症的发生。位点的突变能够引起相关氨基酸结构和功能的改变，从而导致癌症的发生。在我们的前期研究[2]中发现位于BCL2基因的位点rs1800477通过关联分析发现与前列腺癌存在相关，在本研究中用细胞划痕实验对上述结果进行验证。 　　1材料与方法 　　1.1主要试剂与材料 　　LNCaP细胞系由天津南开大学赠送。Taq polymerase （SinoBio 批号E001-02B）， dNTP（Takara， 批号D4030A），胎牛血清（Gibco），REMI Medium 1640（Gibco），限制性内切酶（NEB），BamHI/Agel酶切（上海吉凯基因化学技术有限公司），GV166载体（上海吉凯基因化学技术有限公司），positive clone测序（美季生物技术，型号ABI3730），PCR仪（Applied Biosystems， 美国），细胞培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），细菌摇床（华利达实验设备公司，型号HI-92111K），37℃，Gilson移液器（吉尔森公司），5%CO2恒温培养箱（CEDCO）。 　　1.2 过表达慢病毒载体的构建 　　1.2.1载体酶切： 基因信息：基因名称为BCL2（NM-000633），物种为Human。载体信息：①载体名称：GV166。②元件顺序：Ubi-MCS-3FLAG-IRES-puro。③克隆位点：BamHI / AgeI。酶切反应体系：37℃，2h。试剂体积：ddH2O 42μL；10×buffer 5μL；纯化的DNA质粒（1g/L） 2μL；Agel（5U/μL）。 　　1.2.2 目的基因片段的获取：引物交配碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因，具体序列为：BCL2-F：aggtcgactctagaggatcccgccaccatggcgcacgggagaac； 　　BCL2-R：agtccatggtggcgaccggctgtggcccgataggcac。 　　PCR反应体系：ddH2O 12.4μL；5×Taq buffer 4μL；dNTPs（2.5mmol/L） 1.6μL；Primer（+）（10μmol/L） 0.4μL；Primer（-）（10μmol/L） 0.4μL；Template（10g/L） 1μL；Taq polymerase 0.2μL。PCR反应条件：94℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，∞ ；30