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亮菌产漆酶液体和固体发酵条件优化 　　摘要：为了探讨液体和固体发酵条件对亮菌（Armillariella tabescens）产漆酶的影响，采用正交试验对亮菌液体和固体发酵产漆酶培养基和培养条件进行筛选。供试亮菌在液体培养时产漆酶甚微，在培养基和培养条件优化后最高酶活为7.92 U/mL；固体发酵时在以葡萄糖浓度0.6%、稻草麦麸质量比3∶7、温度27 ℃、含水量65%、接种量11 mL/100 g培养时漆酶酶活可达3 496.7 U/g。固体发酵的酶活显著高于液体发酵，固体发酵更适宜亮菌产漆酶。 　　关键词：亮菌（Armillariella tabescens）；漆酶；液体发酵；固体发酵 　　中图分类号：TQ925 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）06-1410-05 　　漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，与抗坏血酸氧化酶、血浆铜蓝蛋白和胞外胆红素氧化酶同属于铜蓝氧化酶（Blue multicupper oxidase）家族[1，2]。1883年，日本学者吉田（Yoshida）[3]首次从日本漆树（Rhus verniciflua）树汁中发现了一种可以使树漆迅速氧化、硬化的酶；1894年，这种酶被分离纯化，并被命名为漆酶[4]。多年来的研究证明，漆酶在自然界中分布于多种植物、真菌、少数昆虫和细菌中，尤其在白腐真菌系统中分布更为广泛，现已成为研究的热点。漆酶具有的独特功能使其具有巨大的生物利用潜能，如纸浆的去木质化、染料脱色、废水脱毒、食品加工和制药等[5]。 　　亮菌（Armillariella tabescens）又名假蜜环菌，因由柳树发光朽木分离出菌种，菌丝体在暗处有荧光，故称亮菌[6]。亮菌中含有亮菌甲素、乙素、丙素、氨基酸、多糖等多种化学成分。民间用亮菌治疗胆囊炎和传染性肝炎有显著效果，现代药理研究表明亮菌具有醒酒[7]、保肝[8]、防辐射[9]、增强免疫[10]和抗肿瘤[11]等多种功效。为此，在前期工作的基础上，以漆酶酶活为检测指标，对亮菌液体发酵和固体发酵产漆酶的条件进行了研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 供试菌种 亮菌（Armillariella tabescens）菌种由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供，培养保存于浙江医药高等专科学校实验室。 　　1.1.2 主要试剂 ABTS[2，2′-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐]购自美国Sigma公司，愈创木酚购自上海晶纯试剂有限公司，其他试剂均为国产分析纯。 　　1.1.3 仪器与设备 TU-1810SPC型紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司，Biofuge Stratos冷冻离心机购自德国贺利氏公司，PHS-3C型pH计购自上海精科仪器有限公司，BCM-1000型生物净化工作台购自苏州净化设备有限公司，SPX智能型生化培养箱购自宁波江南仪器厂，BS124S型电子天平购自赛多利斯科学仪器有限公司，HH-2型恒温水浴锅购自国华电器有限公司，BSD-226SK型冰箱购自青岛海尔股份有限公司。 　　1.1.4 培养基 综合PDA固体培养基（%）：葡萄糖2.0、琼脂粉1.8、土豆汁20、MgSO4?7H2O 0.15、KH2PO4 0.3、VB1 0.005；液体种子培养基（1 L）：葡萄糖20 g、蛋白胨15 g、KH2PO4 5 g、MgSO4?7H2O 1 g、（NH4）2SO4 5 g、玉米粉20 g、pH 6.0；液体发酵正交试验培养基（1 L）[12]：小分子碳源、高分子碳源、无机氮源、有机氮源、CaCl2 1 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1 g、VB1 0.05 g、吐温-80 0.5 mL、微量元素8 mL、pH 6.0；液体发酵培养基微量元素（1L）：MnSO4?2H2O 0.5 g、NaCl 1 g、FeSO4?7H2O 0.1 g、ZnSO4?7H2O 0.1 g、CuSO4?5H2O 0.1 g、H3BO3 0.01 g；固体发酵正交试验培养基（%）：葡萄糖、碳源、氮源、水、（NH4）2SO4 0.5、CuSO4 0.03、CaCl2 0.47、KH2PO4 0.5、MgSO4 0.2、 VB1 0.005、pH 6.0。 　　1.2 方法 　　1.2.1 培养方法 　　1）斜面及平皿菌种培养。在无菌条件下接种斜面和平皿培养基，于26 ℃避光培养7 d，于4 ℃冰箱保存，备用。 　　2）种子液培养条件。250 mL三角瓶装100 mL种子液培养基，在无菌条件下用打孔器（直径0.5 cm）量取2块平皿培养基的菌丝块接种至种子液中，置于27 ℃摇床以120 r/min避光培养7 d。 　　3）液体发酵培养条件。将种子液按6%的