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均匀设计在酿酒酵母电转化条件研究中应用 　　摘要：电穿孔方法是一种高效导入外源DNA的技术。通过电转化法对酵母YPH 500进行外源DNA转化，研究了电转化中各因素对酵母转化率的影响。结果表明，电场强度、外源DNA浓度、感受态细胞状态对转化率有明显影响。采用均匀设计试验，利用逐步回归方法对试验结果进行分析， 结果表明，当电场强度在1 750 V，酵母OD 600 nm在1.3，外源DNA浓度为7.5 mg/L时，酵母转化率较高，约为24×102转化子数/μg DNA。 　　关键词：电转化；酿酒酵母；均匀设计 　　中图分类号：Q785；S963.32+7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0693-04 　　酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种模式生物，常常作为表达系统。近些年，研究者常利用它进行外源基因的表达或其他基因操作技术，所以外源基因的导入是进行试验的先决条件。20世纪80年代，研究者开始利用电转化法将外源DNA导入酵母细胞，该方法现已成为常用方法[1，2]。在转化时，试验结果往往受感受态细胞状态、外源DNA浓度、电场强度等多个条件的影响，需要探索最佳电转化率的条件。但其中涉及多因素、多水平的试验，常规探索性试验工作量较大。均匀设计具有试验次数少，信息量大的优点，只需做少量试验，建立数学模型，就可得到最佳的配比。本试验将穿梭质粒通过电转化到酿酒酵母YPH 500中，从中考察电场强度、外源DNA浓度和酵母细胞不同的生长状态下3个因素对电转化的影响，以期为酿酒酵母电转化的应用提供参考依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料与仪器 　　1.1.1 菌种和质粒 酿酒酵母YPH 500（遗传背景：MATα ura3-52 lys2-801anber ade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1）、穿梭质粒pRS405由美国新泽西州医学院微生物学与分子遗传学部Carol S. Newlon教授赠送。 　　1.1.2 培养基 YPD培养基：1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖（固体培养基琼脂含量1.5%）。SD筛选培养基：1.34%YNB，2%葡萄糖，2%琼脂，氨基酸（ade、ure、trp、his、lys，均为20 mg/L），SD全营养培养基：在SD筛选培养基的基础上加100 mg/L leu。 　　1.1.3 试剂与主要仪器 1 mol/L山梨醇（南京博尔迪生物科技有限公司）；DP103型小提试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]。2510型电转仪、高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；722型可见光分光光度计（上海驰唐电子有限公司）；紫外分光光度计（美国Merinton公司）；光学显微镜[OLYMPUS（中国）有限公司]。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 酵母YPH 500生长曲线的测定 将冻存菌种在YPD固体培养基上划线，30 ℃培养3～4 d。立即挑取单菌落接种于含有100 mL YPD液体培养基的250 mL锥形瓶中，30 ℃、180 r/min培养。每隔2 h取样测定OD600 nm值，同时通过细胞计数板计数。绘制酵母菌生长曲线。 　　1.2.2 外源DNA的制备 在穿梭质粒pRS405上搭载酵母ARS304片段，导入大肠杆菌DH5α中储存。采用DP103型小提试剂盒提取pRS405- ARS304质粒。将所得产物用紫外分光光度计测量质粒含量。 　　1.2.3 感受态细胞的制备 挑取活化好的酵母单菌落接种于含有50 mL YPD液体培养基的250 mL锥形瓶中，30 ℃ 180 r/min培养。将培养好的细胞冰上放置10 min，倒入50 mL离心管中，4 ℃、1 300 r/min离心5 min。去掉培养液，用50 mL预冷的无菌水将菌体沉淀重悬，重复此步骤，洗涤2遍。再加入10 mL冰冷的1 mol/L山梨醇重悬菌体。最后加入1 mL冰冷的1 mol/L山梨醇。 　　1.2.4 电转化单因素验证 将制备好的不同时期感受态细胞、外源DNA分别混匀进行以下处理，电转化体系均为60 μL。①外源DNA 浓度5.0 mg/L，取不同感受态细胞的OD600 nm（0.2、0.4、0.7、1.1、1.3、1.4、1.5）进行处理，感受态细胞用量80 μL，电场强度1 500 V；②感受态细胞OD600 nm为 1.1，用量为80 μL，取不同外源DNA浓度（0.25、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mg/L ）进行处理，电场强度1 500 V；③感受态细胞OD600 nm 为1.1，外源DNA浓度5.0 mg/L，取不同电场强度（600、900、1 200、1 500、1 800、2 100、2