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一种噻嗪类利尿药用药指导多重SNP检测方法 　　摘要：目的：为患者提供一种用于噻嗪类利尿药用药指导的多重SNP检测方案。方法：采用多重PCR和毛细管电泳片段分离技术，同步检测15个SNP位点的30个基因型。结果： 30个基因型、1个人基因组DNA内参及1个PCR反应内参可以在同一个反应管中扩增，在毛细电泳时清晰分离。 　　关键词：噻嗪类利尿药；SNP；个体化用药 　　自1957 年氯噻嗪问世以来， 以氢氯噻嗪为主的噻嗪类利尿药一直是临床治疗高血压病的常用一线药物，但在临床应用中，其疗效和副作用存在着明显的个体差异。研究表明，这些个体差异与单核苷酸多态性（SNP）密切相关，其中15个位点：SLC12A3r1]，WNK1 的rs1159744[2]、rs880054[3]、rs2277869[2] [3]、rs2286007[2]和rs2107614[2]、NOS3 rs1799983[4]和rs2070744[5]，ADRB2rs2400707[2]、SLC22A6 r6]、ACE rs1799752[7]，YEATS4 rs7297610[8]，CYP11B2 rs1799998[7]，ADD1 rs4961[9]，NEDD4L rs4149601[10]尤其重要，检测这些基因型可以提前预估噻嗪类利尿药的疗效和敏感性等。 　　本研究开发了一种用于噻嗪类利尿药用药指导的多重基因检测试剂盒，同步检测10个基因15个SNP位点的等位基因型，为临床提供了一种噻嗪类利尿药用药指导多重基因检测方案。 　　1. 材料和方法 　　DNA提取 　　以抗凝静脉血作为样本进行DNA提取。DNA提取在自动化提取工作站SmartLabAssist-32（台湾圆点奈米技术有限公司）上完成。试剂盒使用 “核酸自动提取试剂盒（磁珠法）”（宁波海尔施基因科技，货号：1060055）。 　　PCR扩增 　　PCR扩增反应： PCR预混液16 L、Taq DNA聚合酶2？L、样品DNA /5FU阳性对照2L。混匀后按以下温度进行热循环反应：94℃3分钟；94℃30秒，60℃30秒，70℃30秒，共35个循环； 72℃3分钟；4℃保存产物。 　　DNA片段分离 　　采用GeXP遗传分析仪（美国贝克曼库尔特公司）进行DNA片段分离， 详见说明书。 　　2. 结果 　　噻嗪类试剂盒检测人DNA样品，因每个SNP位点有可能出现2个基因型峰，故共可能出现17-32个特征峰，其中15-30个为SNP特征峰、1个人DNA内参特征峰和1个PCR反应内参pcDNA特征峰。阳性对照检测结果应出现全部32个特征峰（图1）。 　　图1、本试剂盒检测阳性对照结果。共出现32个特征峰：30个基因型峰和2个内参峰。 　　3. 讨论 　　目前常用的SNP检测方法：qPCR法的优点是灵敏度高、准确性强，其缺点是通量低且探针成本高；DNA芯片有高通量等优点，其缺点为成本昂贵、灵敏度低、重复性差且准确性低；Sanger测序法是SNP分析金标准，能发现已知SNP和未知SNP，缺点是工作量大，周期长，多位点检测累计价格相对昂贵 。 　　本研究提供了一种快速、准确同步检测多个SNP位点用于指导噻嗪类利尿药用药指导的新方法。目前，国内外尚无类似的研究报道。 　　参考文献： 　　[1]. Matayoshi T， et al. The thiazide-sensitive Na（+）-Cl（-） cotransporter gene， C1784T， and adrenergic receptor-beta3 gene， T727C， may be gene polymorphisms susceptible to the antihypertensive effect of thiazide diuretics.[J] Hypertens Res. 2004 Nov；27（11）：821-33. 　　[2].Turner ST， et al.WNK1 kinase polymorphism and blood pressure response to a thiazide diuretic. [J] Hypertension. 2005 Oct；46（4）：758-65. 　　[3].Manunta P， et al. Physiological interaction between alpha-adducin and WNK1-NEDD4L pathways on sodium-related blood pressure regulation.[J] Hypertension. 2008 Aug；52（2）：366-72. 　　[4].Turner ST， et