吲哚美辛抑制大鼠子宫内膜异位症微血管形成实验研究.docVIP

吲哚美辛抑制大鼠子宫内膜异位症微血管形成实验研究 　　摘要：目的研究吲哚美辛对大鼠子宫内膜异位症微血管的影响。方法建立大鼠子宫内膜异位症模型。随机分组：治疗组喂服吲哚美辛(5mg?kg-1?d-1)，对照组给予相应体积溶剂(0.2%二甲亚砜-生理盐水溶液)。4w后处死动物，采用免疫组化法检测子宫内膜组织中微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达，兔抗大鼠CD34标记微血管。结果子宫内膜体积治疗组和对照组MVD分别为15±3和27±5(P　　关键词：吲哚美辛；子宫内膜；血管生成；微血管密度；血管内皮生长因子 　　持续的血管生成是子宫内膜异位症的发生发展的一个关键因素,新生血管为子宫内膜细胞提供增殖所必需的营养物质、氧气及各种生长因子。据此，Shifren在1996年首次提出抑制子宫内膜的血管形成可作为治疗子宫内膜异位症的一种手段[1]。吲哚美辛是一种非甾体抗炎药，近年来大量研究资料表明，吲哚美辛可有效降低血管内皮生长因子(VEGF)表达，减少微血管密度(MVD)[2,3]。本实验以大鼠子宫内膜异位症模型为研究对象，观察吲哚美辛对子宫内膜及其新生血管的影响。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料吲哚美辛（美国Sigma公司）、二甲基亚砜(DMSO)（美国MPBIO公司）。吲哚美辛溶于DMSO中，应用前临时避光配制。健康成熟未交配雌性Wistar大鼠(60d～70d)，每只体重190g～240g(由中山大学动物实验中心提供。兔抗大鼠CD34和血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体为Santa Cruz产品，ABC试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。 　　1.2建立大鼠子宫内膜异位症模型参考Zulfikaroglu[4]方法,选用成熟雌性Wistar大鼠，切取子宫角组织一块，分离出内膜组织并将其缝合在腹膜上，子宫内膜面向腹腔。 　　1.3实验分组模型手术后3w，第2次开腹，将造模成功者随机分为两组(5只/组)：治疗组用灌胃法每日喂服吲哚美辛(5mg?kg-1?d-1)；对照组喂服0.2%的DMSO-生理盐水液。连续喂服4w。 　　1.4免疫组织化学染色每只大鼠在治疗结束后24 h内处死，立即手术取异位内膜组织，常规处理，10％多聚甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋，连续切片(5μm)，行CD34和VEGF免疫组织化学染色。CD34和VEGF染色均采用ABC法（卵白素-生物素-酶复合物染色法），参照试剂盒说明逐步操作。各组标本同一批染色，以PBS代替一抗作阴性对照。 　　子宫内膜微血管密度(MVD)计算方法：CD34标记微血管，计数子宫内膜内着色的毛细血管和微小血管。参考Guset[5]的评估标准，凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为1个血管计，但肌层较厚及管腔面积大于8个红细胞直径的血管不计数。计数方法，首先用10×10低倍镜头扫视整张切片，确定微血管最密集的3个视野(新生血管热点区)，然后在高倍镜(10×40)视野范围内计数所有染色的微血管。取3个视野计数结果的均数为该切片的微血管数。 　　VEGF判断标准：VEGF蛋白表达均以细胞质或细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。参考Guset[5]的方法判断染色结果，根据细胞染色强度分为4级，并分别计分：阴性为细胞无着色(0分)；弱阳性为浅黄(1分)；中度阳性为棕黄(2分)；强阳性为棕褐(3分)。在每张切片上随机选取10个视野(10×10)，计数每一强度视野数所占的比率(F)，根据下列公式计算每张切片的平均染色强度。IS(intensity score)=∑[(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)]，F=10×视野%。 　　1.5统计学处理所有数据采用SPSS 11.0 统计软件分析。两组均数比较分别采用Students t-test。 　　2结果 　　子宫内膜组织内MVD及VEGF表达CD34标记血管内皮细胞，所有子宫内膜组织均有阳性表达。内皮细胞被染成棕黄色，微血管有的形成管腔，有的仅为单个内皮细胞或内皮细胞簇(图1)。治疗组内膜组织中MVD明显少于对照组(P 　　参考文献： 　　[1]Shifren J L, Tseng J F, Zaloudek C J, et al. Ovarian steroid regulation of vascular endothelial growth factor in the human endometrium: implications for angiogenesis during the menstrual cycle and in the pathogenesis of endometriosis[J]. The Journal of clinical endocrinology and metabolis