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垂盆草醇提物抑制HepG2细胞STAT―3信号通路诱导细胞凋亡研究
垂盆草醇提物抑制HepG2细胞STAT―3信号通路诱导细胞凋亡研究 [摘要] 目的:研究垂盆草醇提物对STAT-3信号通路的影响,及其诱导细胞凋亡的分子机制。方法:MTT法检测垂盆草醇提物对HepG2细胞增殖的影响;流式细胞术分析结合FITC-Annexin V/PI双标记检测对肝癌细胞凋亡的影响,免疫印迹试验检测细胞凋亡Caspase-3,Caspase-9,PARP,P-STAT-3(Tyr705),STAT-3,Bcl-2,Mcl-1相关蛋白表达水平。结果:垂盆草醇提物可明显抑制HepG2细胞的增殖,诱导HepG2细胞凋亡,且抑制作用呈剂量依赖效应。垂盆草醇提物作用后,抑制STAT-3信号转导通路,下调Mcl-1和Bcl-2的表达,引起凋亡相关蛋白Caspase-3,Caspase-9的降解/活化及PARP的降解,并呈剂量依赖效应。结论:垂盆草醇提物通过抑制STAT-3信号转导通路和Mcl-1和Bcl-2的表达,进而抑制HepG2细胞的增殖,诱导其凋亡。 [关键词]垂盆草;细胞增殖;细胞凋亡;STAT-3;Mcl-1;Bcl-2;信号转导;HepG2细胞株 肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发病率居各类肿瘤的首位。化疗是肝癌的主要治疗手段之一,但效果并不十分理想。因此,从药用植物资源中寻找高效低毒的化合物用于肝癌的治疗受到各国学者的高度重视[1-4]。垂盆草Sedum sarmentosum Bunge又称卧茎景天,系景天科多年生草本植物,分布于全国大部分地区。垂盆草为药食两用植物,营养价值丰富[5]。垂盆草主要含有垂盆草苷类、黄酮类、三萜类、甾醇、生物碱及糖类。此药性凉,味甘、淡,新鲜或干燥全草入药。作为一种重要的药用植物资源,在民间被用于治疗咽喉肿痛、水火烫伤、蛇虫咬伤等已有多年的历史[6]。药理学研究表明,垂盆草具有免疫抑制作用[7]、雌激素样作用[8]、血管紧张素转化酶抑制作用[9],能够降低血清丙氨酸氨基转移酶水平,抑制炎性渗出,减少肝细胞的损伤,所以在临床上被广泛用于治疗各型慢性病毒性肝炎[10]。此外,垂盆草还具有明显的抗肿瘤效果,但机制尚不清楚[11]。为了研究垂盆草抗肿瘤的作用机制,本实验以人HepG2肝癌细胞为研究对象,探讨其对STAT-3信号通路的影响,以及抑制细胞增殖、诱导凋亡的抗肿瘤效应,为进一步开发利用垂盆草提供理论和实验依据。 1 材料 1.1 药品与试剂 MTT购自Genview;AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD Pharmingen公司;碘化丙啶(PI)购自美国AMSCO公司;ECL Western blot显色试剂盒购自Pierce;Bcl-2抗体和Mcl-1抗体购自Santa Cruz;P-STAT-3(Tyr705)抗体、STAT-3抗体、Caspase-3抗体、Caspase-9 抗体和PARP 抗体购自Cell Signaling;βactin抗体购自Sigma公司;二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;DMEM 培养基购自Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。 1.2 仪器 FACS calibur流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司);Thermo细胞培养箱(美国Thermo公司);OLYMPUS倒置相差显微镜(日本);Thermo Varioskan Flash型多功能酶标仪(美国Thermo公司)。 1.3 细胞 人肝癌细胞株HepG2细胞购自美国ATCC 细胞库。 2 方法 2.1 垂盆草醇提物(ESB)的制备 垂盆草干草1 000 g,于95%的乙醇10 L中浸泡6 d,过滤,收集药液。重复3次,合并药液,离心取上清,所得上清液经减压蒸发挥去溶剂,再用石油醚经索氏提取法去除脂类,挥去石油醚,再用甲醇溶解,减压蒸干得醇提物。 2.2 细胞培养 HepG2细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基,于37 ℃,5%CO2培养箱中培养。当细胞密度达80%~90%时,弃掉培养液,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍,加入消化液(0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶),37 ℃消化3 min。倒置显微镜观察细胞变圆、收缩、细胞间隙增大时,弃掉消化液,加培养基制成单细胞悬液,分装到新的培养瓶中,用于后续试验。 2.3 MTT法检测细胞增殖 实验分为阴性对照组(DMEM)和不同浓度垂盆草醇提物处理组(50,100,200 mg?L-1)。MTT比色法[9]分别测定垂盆草醇提物作用24,48,72 h后HepG2细胞的吸光度(A),每组实验均重复3次。 2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 50,100,200 mg?L-1垂盆草醇提物分别处理HepG2细胞24 h后,每组设
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