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四重组蛋白质地鉴定
凝胶介质的基本性质 葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100 葡聚糖凝胶对碱比较稳定,在酸性环境中其糖苷键易水解 湿态的葡聚糖可加热到110℃,干的则能耐受120℃高温 葡聚糖凝胶( Sephadex ) 葡聚糖凝胶G10 <700 葡聚糖凝胶G15 <1500 葡聚糖凝胶G25 1000-5000 葡聚糖凝胶G50 1000-30,000 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶,常见的有Sepharose ( Sepharose 2B、4B、6B)。 琼脂糖凝胶 当温度高于50℃时琼脂糖凝胶便融化,只能在较低的温度下使用。 琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶,因而适合于分离分子量较大的生物大 分子物质(如蛋白质和DNA)。 聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联 而成的人工合成凝胶,控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶,交 联剂越多,孔隙越小。 聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel,型号从P-2至P-300共10种 聚丙烯酰胺凝胶 凝胶介质的选用原则 将样品中的大分子物质与小分子物质分开,称为组别分离,其分 离策略是使高分子物质完全被排阻,小分子物质完全渗入凝胶内。 组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50,对于小肽和低分子量 的物质(分子量范围1000-5000)的脱盐可选用Sephadex G-10、G- 组别分离 15、Bio-Gel P-2或P-4 将样品中一些分子量比较接近的物质分开,这种分离叫分级分离 分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。 在层析过程中,样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部,但由 分级分离 于深入凝胶空隙程度上的差异,最后得到分离。 凝胶层析的基本操作 平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速 注意凝胶的断层和气泡 层析柱平衡 操作压控制 平衡和洗脱时应维持流速恒定 上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定: 进样体积 进行组别分离时,样品溶液最大可为柱体积的10% 进行分级分离时,样品溶液的体积要小,使样品层尽可能 窄,这样洗脱出的峰形好 3. 亲和层析 亲和层析的基本概念 亲和层析载体的性质与选择 亲和层析配基的性质与选择 亲和层析的基本操作 亲和层析的基本概念 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力 进行分离的一类特殊的层析技术,它有如下特点: 纯化过程简单、迅速,且分离效率高 特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子 亲和层析的基本特点 纯化倍数大,产物纯度高 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件 因此应用范围受到一定的限制 抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA(cDNA、mRNA) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体 具有特异性亲和作用的生物分子 维生素于其特异性结合蛋白 糖蛋白与其相应的植物凝集素 亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连 作为固定相吸附剂 当含有混合组份的样品(流动相)通过此固定相时,只有 和固定相分子有特异亲和力的物质,才能被固定相吸附结 亲和层析的基本原理 合,其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出 然后改变流动相成份,将结合的亲和物洗脱下来 亲和层析(affiuity chromatography) 应用 分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能 + 待纯化分子 配体 a. 理论依据:待纯化分子和配体间具有亲和性 + 基质 b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂 + + 杂质 c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合,与杂质分离 + d. 偶联复合物经解离后,得到纯的待纯化分子 原理: 基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex 亲和层析原理示意图 蛋白质混合物 配体 与配体结合的蛋白质 加入的可溶性配基 专一性结合蛋白质 没有结合的蛋白质 非专一性结合蛋白质 蛋白质浓度 洗脱体积 与配体专一性结合蛋白质 加入配基 基质 亲和层析载体的性质与选择 具有多孔的立体网状结构,能使被亲和吸附的大分子自由通过 具有良好机械性能的均匀珠状颗粒,具有良好的流速 亲和层析载体的选择 具有惰性,尽量减少非专一性吸附 具有相当量的易活化的基团,在温和的条件下能与配基共价合 偶联 在偶联、吸附和洗脱时,有较好的物理化学稳定性 纤维素 葡聚糖凝胶 常用的亲和层析载体 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 其它新型载体 纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力 但亲和力太高也
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