体内药物分析免疫分析法.ppt

免疫分析法 Immunoassay 第一节 概述 1959年，美国R.Yallow和Berson等人： 开创性地 放射性同位素示踪技术的高灵敏性 免疫反应的高特异性 测定糖尿病人血浆中的胰岛素，从而创立了RIA法，1977年获诺贝尔医学奖。 一、基本原理 （一）竞争抑制原理 B%=B/(B+F) ×100%=B/T ×100% 特异性 可逆性 最适比例性 二、基本条件 免疫分析必需三种基本试剂：标记抗原、非标记抗原和特异抗体 滴度(Titer) （又称效价或工作稀释度） 稀释倍数 表示滴度 活度（Avidity） （抗体与相应抗原的亲和力） 特异性（Specificity）或专属性 三、方法分类 第二节 放射免疫分析 RIA 二、F与B的分离技术 a. 对分离方法的要求： 使结合部分（B）与游离部分（F）尽可能分离完全 分离后便于放射性测量 分离效果不受外界干扰因素的影响 操作简便、分离迅速、重复性好 与游离标记物的非特异性结合尽可能小 试剂来源广泛、价格低廉 b. 常用的分离方法 沉淀法：抗体为蛋白，常用蛋白沉淀剂 --硫酸铵 吸附法：固体吸附剂吸附游离抗原，有 DCC、纤维素、硅酸盐等。 固相法：抗原、抗体结合物B附在固相载体表面，游离抗原F在反应液中。 双抗体法：第二抗体沉淀可溶性抗原-抗体结合物，离心分离。 三、放射性免疫测定仪 （1）125I、131I—γ射线， γ计数器 （2）3H、14C—β射线， 液体闪烁测量仪 四、标准曲线的制备与样品测定步骤 （一）标曲的绘制 取标准抗原、用无放射性的空白血清或血浆稀释成5-8个系列浓度 加入定量标记抗原，其总放射性（T）应能满足准确测量的要求 加入定量的已稀释好的特异抗体，其抗体的量应满足灵敏度要求 混匀后，在适当条件下温育，待反应平衡后测定总计数率（T） 加入分离剂，使结合部分与游离部分分离 测定各管结合部分或游离部分的计数率 绘制标准曲线 放射免疫分析的临床应用 临床常用近 200 种 （1）肿瘤相关抗原的测定：AFP、CEA 、CA199、CA-125、CA153、CA724、CYFRA211、PSA 等 （2）激素的测定：下丘脑-垂体-甲状腺轴激素，下丘脑-垂体-性腺轴激素，下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴激素，胃肠道激素，心血管激素，甲状旁腺素与降钙素，生长激素等 （3）非激素蛋白质的测定：铁蛋白、各种尿微量蛋白、铜蓝蛋白、肌红蛋白、血栓素、III 型前胶原肽、层黏蛋白等 （4）酶的测定：前列腺酸性磷酸酶、SOD、NSE 等 （5）药物及维生素的测定：地高辛、叶酸、VitB12 等 （6）免疫分子的测定：各种 Ig、抗 DNA、IL、CD、CIC （7）病原学研究：现已基本淘汰，但细菌代谢产物的测定仍有一定的价值 （8）其它：甘胆酸、透明质酸等 第三节 酶免疫分析法 EIA EIA是以酶作为标记物的免疫测定方法。 与RIA的不同之处是用具有高效专一催化特性的标记酶代替放射性同位素标记物。 酶标药物的制备考虑原则 对酶和抗体（应为抗原 P228第一行）的活性无影响或影响很小 生成的结合物是可溶性的，稳定的 反应条件容易控制 制备方法应简单、重复性好 竞争法 双抗体夹心法 改良双抗体夹心法 第四节 化学发光免疫分析 CLIA 二、化学发光免疫分析的类型 （二） 化学发光酶免疫分析法 第五节 荧光免疫分析 FIA 一、荧光标记物 具有同待测药物连接的活性基团，连接后的标记药物同抗体结合后，其荧光性质最好能发生改变。 稳定，并具有较高的荧光效率； 药物上的抗原决定簇不能被覆盖 二、荧光免疫分析的类型 底物标记荧光免疫分析 荧光偏振免疫分析 荧光猝灭免疫分析 荧光增强免疫分析 时间分辨荧光免疫测定 底物标记荧光免疫分析 荧光偏振免疫分析 FPIA （二）标准曲线的建立 荧光猝灭免疫分析 FQIA 时间分辨荧光免疫测定 TRFIA E 基本原理 荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图 碱性磷酸酶标记抗体或抗原，固相载体包被抗原或抗体，酶分解4-MUP，脱磷酸根基团形成4-MU，360nm激发光照射，发出450nm荧光。 荧光酶免疫测定 方法类型 双抗体夹心法 固相抗体和酶标记抗体与待检原反应，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物进行酶促发光反应，发光量与待检抗原含量成正比。 荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）示意图 荧光酶免疫测定 磁性微球 四、方法评价 优点：对人体无放射性伤害、不污染环境,